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産品服務

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10X Genomics 單細胞 RNA-Seq

單細胞RNA測序技術概述

       目前高通量測序技術已經深入到人類疾病、物種進化、動植物分子育種等傳統的生物學研究領域中,逐漸成為一種不可或缺的研究工具。然而随着生命科學和醫學基礎研究的深入發展,人們發現越來越多的特殊标本和特定的生物學現象,如法醫鑒定的微量标本、腫瘤内部異質性等無法用常規組織測序的方法進行研究。單細胞測序技術的出現,給這類樣本的研究帶來了極大的便利。

       單細胞測序技術經過了10餘年的發展,取得了衆多的技術進展與突破。其中,單細胞RNA測序技術中,Smart-Seq方法以其可實現完整mRNA擴增的優勢,被廣泛的應用。而近期廣受關注的另外一個高通量單細胞RNA測序技術由Macosko E團隊開發,其研究成果于2015年發表在《Cell》雜志上,該技術結合了微流控液滴法,磁珠對細胞進行标記,可一次性完成多至一百萬個細胞分離和擴增建庫,這個技術的出現大幅的降低了單細胞RNA測序的成本,使得單細胞RNA水平的研究得到了飛躍發展。

       華大基因依托于這兩個技術開發優化的相應單細胞RNA測序産品:單管單細胞RNA測序高通量單細胞RNA-Seq 。其中,高通量單細胞RNA-Seq産品依托于Droplet技術(液滴法),可實現上萬個單細胞的同時進行分離和建庫,大幅的降低建庫成本的同時實現全局性的組織細胞轉錄圖譜。


應用範圍

各組織細胞圖譜構建;疾病緻病機理研究;腫瘤及微環境研究;免疫學研究;植物單細胞研究


産品優勢

國内首發單細胞産品,資深單細胞研發團隊,

接受多種的樣本類型,提供優質的上門服務,

自主測序平台優質穩定,頂尖期刊發表多篇文章,

信息分析現已全面升級,CNNS級高質量結果,

獨家流式細胞儀細胞分選,單細胞研究目的精準化!


技術原理

       基于10X Genomics平台的高通量單細胞RNA-Seq技術是利用液滴法的原理,使用GemCode技術,通過控制微流體的進入,将帶有barcode、UMI(Unique Molecular Index,分子标簽)、引物及酶的凝膠珠(Gel Beads)與單細胞混合,從而實現大規模的單細胞分離,以及單細胞文庫構建的技術。

圖6 10X Genomics技術原理示意圖

圖1  10X Genomics技術原理示意圖

       10X Genomics平台的液滴封裝大約有50%的捕獲效率,可在6分鐘内完成。分離完成後會形成一個GEM(Gel in Emulsion)的液滴結構,在這個液滴結構内,包含了一個凝膠珠,一套反應需要的試劑以及目标細胞,通過一套75萬個barcode序列系統地對每個液滴進行唯一标記,随後上機測序,再利用信息分析的方法進行barcode序列的拆分,可實現一次100-10000個細胞的分離和文庫構建。

實驗流程

       首先将樣本制備成單細胞懸液,随後進行上機前細胞計數和細胞活率檢測,若細胞活率≥80%,則将細胞濃度調整為700-1200個/μL。将制備好的細胞懸浮液利用微流控芯片,将帶有細胞标簽序列(cell  Barcode)的凝膠珠(bead)和細胞包裹在液滴中。在液滴中,細胞破裂,釋放的mRNA與凝膠珠上的細胞标簽序列相連,形成單細胞GEMs結構(Gel Bead in Emulsions)。細胞的mRNA在液滴中進行逆轉錄反應形成cDNA,随後破乳,進行 cDNA 的文庫構建。通過文庫序列上的細胞标簽序列可以區分目标序列來自于哪一個細胞。

       細胞和反應試劑在微流控芯片上的一條通道中,凝膠珠在另一條通道,共同形成GEM。在每個GEM中獨立進行反轉錄,之後帶有标簽的 cDNA 将被混合然後擴增再進行文庫構建。

 圖8   GemCode平台單細胞RNA-Seq工作流程圖

圖2 GemCode平台單細胞RNA-Seq工作流程圖 

測序策略

測序平台:BGISEQ平台

測序讀長:PE100


信息分析流程

       測序得到的原始數據我們稱之為Raw reads,之後我們會根據10X Genomics單細胞RNA-Seq獨特的文庫結構,對Reads的Barcode 、 UMI 和插入片段部分進行拆分,之後插入片段部分将比對到參考基因組,然後統計比對到各個區域的比例,并進行表達量統計;基于表達量的結果,進行細胞時間軌迹預測,細胞聚類等分析,基于差異表達的結果,進行KEGG富集,GO富集,蛋白互作網絡分析等。

表1 信息分析内容

信息分析條款

信息分析内容

标準信息分析

(需要基于良好的參考序列, 

且每個樣本拆分出的細胞數目上下浮動在20%,

或以内的誤差皆屬于正常範圍

1. 測序結果統計

2. 數據質控統計

3. 比對結果統計

4. 基因表達定量分析

5. Marker基因鑒定

6. 細胞類型注釋

7. 單樣本/多樣本細胞聚類分析

8. 特異marker基因差異分析

9. 樣本間相同cluster基因差異分析

10. cluster差異表達基因GO功能分析

11. cluster差異表達基因Pathway功能分析

12. cluster差異表達基因TF編碼能力預測

13. cluster差異表達基因蛋白互作分析

14. cluster基因相關性網絡分析

高級信息分析

細胞軌迹分析(僅選取時間點樣本可選做)

定制化信息分析

可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析内容


大規模單細胞并行的數字化轉錄圖譜繪制

Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells

雜志: Nature Communications

影響因子: 12.124

細胞類型:外周血單核細胞

研究内容:

       對移植病人中分離出的骨髓單核細胞的轉錄圖譜進行分析,比較捐獻者與被捐獻者的嵌合情況。通過進行單細胞RNA-Seq的分析可以實時監測急性髓性白血病人移植後,以及捐獻者的免疫細胞和受捐獻者的細胞之間的動态變化。文章一共進行29個樣本的單細胞RNA-Seq,合計250,000個細胞。并對68,000的外周血單核細胞進行轉錄圖譜繪制,進行免疫細胞亞群的系統性分類。找到主要的細胞亞群同時,發現了新細胞亞群(0.3% & 0.5%) ,以及對細胞亞群二級關系劃分。

圖 68,000個細胞的高通量單細胞RNA-Seq

圖1: 68,000個細胞的高通量單細胞RNA-Seq,可以清晰的被分成不同功能的細胞亞群

(a)整體細胞的表達量及細胞數中位數分析。(b)t-SNE細胞亞群聚類分析。(c)不同關鍵基因的表達量熱圖分析。(d)基于不同關鍵基因的細胞亞群聚類及表達量豐度分析。

       通過對這些臨床病例的外周血單核細胞進行大規模的單細胞RNA-Seq,可以觀察到細胞亞群的組成比例,以及在HSCT(Hematopoietic Stem Cell Transplantation)患者的骨髓中可能存在的殘留病竈情況,這彌補了常規臨床治療中對這一部分信息的缺失。

圖 移植後骨髓單核細胞的基因型以及對應的單細胞表達譜分析

圖2 移植後骨髓單核細胞的基因型以及對應的單細胞表達譜分析

(a) 通過tSNE projection分析軟件對病人移植前和移植後的細胞進行二維聚類,每個點為一個細胞,不同的顔色表示其所屬于不同的細胞亞群。(b)表示了不同的樣本中,細胞亞群的比例情況。


1、細胞亞群分類

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圖1  細胞分類注釋圖

2、特異marker基因分析

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圖2  cluster特異marker基因小提琴圖

 

3、樣本間cluster差異表達基因分析

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圖3  樣品間不同細胞類型差異基因點陣熱圖

根據選定的顯著9個基因進行表達量熱圖展示

 

 4、樣本間相同cluster基因差異基因分析

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圖4  樣品間相同細胞類型差異基因小提琴圖

橫坐标表示細胞類型,縱坐标表示表達百分比

 



細胞狀态

細胞直徑<40μm;細胞活性>80%;細胞濃度>5×105/ml

細胞懸液背景幹淨,無大量結團、碎片及雜質,不含Ca2+Mg2+


 Q1:通過10X Genomics平台進行單細胞RNA-Seq的組織樣品,是否可以提供前期處理的方法?

目前華大基因《單細胞送樣建議手冊》上有提供通用的組織消化方法可供參考,同時不同組織存在組織及細胞的特異性,使用通用組織消化方法的效率會因組織類型差異,存在消化效率的差異。

Q2:凍存細胞/組織樣本寄送前有哪些注意事項?

需要提前與當地銷售經理溝通,提前告知郵寄到樣時間,加快實驗進程以及确保細胞樣本活性。

Q3:癌症組織樣本可以協助解離服務和上門建庫服務嗎?

可以進行癌症組織樣本組織解離服務和上門建庫服務。

Q4:請問10X Genomics單細胞RNA-Seq可以進行可變剪切等結構變化分析嗎?

10X Genomics單細胞RNA-Seq産品主要定位為基因表達定量分析為主,數據不建議進行可變剪切等基因結構變化分析。如需研究結構變異信息,可進行單管單細胞RNA測序。

Q5:10X Genomics單細胞RNA-Seq采用的3’端擴增技術與Smart-seq2的擴增技術有什麼區别?

Smart-seq2擴增技術針對是的3’~5’端全部的mRNA;3’端擴增技術主要是擴增3’端,是否能延伸至5’端,取決于酶的活性等系列實驗因素決定。因此,擴增産物的長度上會有一定的區别和差異。

Q6:如果客戶現場分離了1000個細胞,并檢測出細胞活度很高,問:可否直接使用1000個細胞進行10X Genomics平台上機?

不建議。因為10X Genomics單細胞RNA-Seq最低建議細胞送樣量為106個細胞,且活率建議在85%以上。

Q7:細胞物種沒有相應的參考基因組,可以做這個産品嗎?

産品分析需要基于一個良好注釋和組裝的參考序列。基因注釋不完善或隻注釋到轉錄本,沒有注釋到基因等的不完善參考序列,會出現占用内存過多,即使對轉錄本進行去冗餘及重新構建,跑出的結果可能會不太好,需要客戶明确其風險因素。

深圳華大科技(總部)

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