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産品服務

Sequencing services

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目标小分子定量

       代謝組學(Metabonomics/Metabolomics)是繼基因組學和蛋白質組學之後新興發展起來的學科,其主要目标是定量地研究生命體對外界刺激、生理病理變化以及基因突變而産生的體内代謝物水平的多元動态反應,其研究對象是相對分子質量 1000 DA以内的小分子物質,如脂類、酮類、有機酸等。

       目标小分子定量分析産品,利用多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)技術,同時對樣品中多種目标小分子的含量進行快速、精确地測定。MRM技術作為一種質譜檢測的分析方法,具有特異性強、靈敏度高、準确度高、重現性好、線性動态範圍寬、自動化高通量的突出優點,這些特質能夠滿足今天很多研究、臨床領域的迫切需要。利用MRM技術進行實時的定量監測可用于藥代動力學研究、臨床診斷、違禁藥物檢查、食品化妝品等工業質量控制、環境檢測、農藥殘留,小分子生物标志物驗證等相關研究。

        MRM技術是基于三重四級杆質譜儀原理,根據已知信息或假定信息設定質譜檢測規則,對符合規則的離子進行信号記錄,去除大量不符合規則離子信号的幹擾,從而得到質譜信息的一種數據獲取方式。

圖1

圖1 MRM工作原理

 樣品經過液相分離系統進入質譜儀進行檢測。第一重四級杆(QuadrupoleQ1)隻允許特定荷質比的化合物離子(母離子)通過,第二重四級杆(Q2)誘導母離子碰撞得到化合物的碎片離子,第三重四級杆(Q3)隻允許特定荷質比的碎片離子(子離子)通過,并且記錄子離子信号。MRM技術通過對母子離子對(Transition)的選擇,去除幹擾離子,降低化學背景,提高物質定量靈敏度。

産品優勢

通量高:一次上機檢測,可同時得到多種小分子的定量信息。

準确性高:通過對目标小分子母子離子對的選擇,去除幹擾離子,靶向精确定量。

重現性好:質譜信号重現性差在一定程度上是因為複雜生物樣本基體和共流出組分對待測分子離子化、質譜信号的抑制及源内碰撞碎裂過程的影響導緻,而在 MRM技術質譜信号采集中,後兩者的影響被大大降低,因此重現性也相應提高。

産品應用

圖2

技術路線

圖3

信息分析

1、标準信息分析

1.1 Transition對選擇

1.2 标準曲線繪制(絕對定量)

1.3 數據質控

1.4 目标小分子定量結果

1.4.1 數據分布

1.4.2 比較組分析

1.5 表型分析(僅适用于pannel類型目标小分子定量分析産品)

2、定制化信息分析

可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析服務内容,包括區分同分異構體等。


1、代謝組學聯合宏基因組學對漢族人群肥胖機制進行研究

Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention. Nature medicine. 2017

背景:腸道微生物的組成和變化會受到許多因素的影響,比如年齡和飲食,然而還有一個平時可能被大家所忽略的因素就是種族。因此,這項以中國漢族年輕人為樣本的研究,對我國腸道微生物與肥胖研究領域來說有着十分重要的意義。本研究是上海交通大學瑞金醫院和華大基因共同完成的。研究人員以中國的漢族年輕人為研究對象,确定了一個能抑制肥胖的腸道微生物——多形拟杆菌,還研究了其對代謝産物氨基酸水平的影響。

 

技術路線:

圖1

主要結論:

1)肥胖志願者的拟杆菌屬細菌大量減少,是因為代謝産物芳香族氨基酸(AAA)以及支鍊氨基酸(BCAA)的增加;這兩類氨基酸在過去的研究中已經被證明與II型糖尿病的發生發展有關。

2)肥胖人群中谷氨酸的含量非常高,與苗條人群的差異也最大,而且在肥胖人群中,它的含量與多形拟杆菌的數量呈反比。

3)多形拟杆菌、谷氨酸含量與肥胖的關系進一步在小鼠模型和人體中進行了确認。

屏幕快照 2018-05-11 下午4

圖1 腸胃微生物種類與循環氨基酸的相關性分析

a 217MLGs和7個氨基酸之間的斯皮爾曼系數;b上圖,與MLGs關聯的血漿中谷氨酸鹽水平及其代謝通路參與基因;b下圖,對照組與肥胖組個體KO富集差異。

2、采用目标小分子預測T2D患者罹患心血管疾病發病風險

Plasma lipidomic profiles improve upon traditional risk factors for the prediction of cardiovascular events in type 2 diabetes. Circulation. 2016

背景:T2D已經成為世界範圍内嚴重影響健康的主要疾病,CVD是T2D的主要并發症且緻死率很高。傳統預測T2D患者是否罹患CVD的方法均存在各種各樣問題,無法進行準确預測。

實驗方案:本文選取3779個二型糖尿病(T2D)患者血漿,且都有不同程度的心血管疾病(CVD)發病風險或死于CVD或有大血管疾病史;采用液相色譜串聯質譜對22類、310個脂質進行目标小分子檢測。采用加權回歸算法計算脂質含量預測未來5年罹患或死于心血管肌病的關系;采用赤池信息量準則優化包含傳統脂質預測風險因素在内的多變量模型;5倍交叉驗證模型中計算C統計和淨重新分類指數(NRI)。後續驗證階段在LIPID隊列511個樣品中進行。


主要結論:

1)發現鞘脂、磷脂、膽固醇脂和甘油糖脂與未來罹患心血管疾病存在關系;

2)在14種傳統預測風險因素基礎上加入另外7種脂質能更好的預測罹患CVD的風險;加入另外4種脂質能更好預測CVD的死亡率;

3)脂質可以作為生物靶标對T2D中的CVD進行風險分級,采用目标小分子檢測可以進行脂質标志物的篩選。

屏幕快照 2018-05-14 上午10

圖2 脂質大類/亞類與未來心血管疾病的風險相關性

采用加權回歸鑒定脂質大類/亞類和未來發生心血管事件的風險(n=698,空心環)以及未來發生心血管死亡的風險(n=355,實心菱形)。風險率經過一系列表型和遺傳因素的矯正。

 


1、方法建立

1.1 MRM質譜方法的建立

通過對質譜參數如母離子(Q1),子離子(Q3),CE,DP,EP,CXP等進行選擇并優化。最終每個目标分子選擇3~7個信号響應最好的transition。

      

       圖片1      

 圖1 MRM質譜方法建立

左上,目标分子一級質譜全掃描;右上,PI子離子掃描模式下,目标分子的二級質譜全掃描,選定強度較高的子離子作為候選;左下,目标小分子的CE優化,橫坐标是CE能量值,縱坐标為離子信号強度;右下,正離子模式下的目标分子MRM質譜方法列表

 

1.2 MRM色譜方法優化及LC-MRM方法驗證

在選擇transition并建立質譜檢測方法後,還需優化液相色譜條件,獲得穩定可靠的LC-MRM色譜-質譜聯用方法用于樣本定量檢測。

          圖片5       

圖2 色譜優化過程中的色譜圖

左圖,标品混合物中目标分析TIC圖;右圖,标品混合物檢測時某個目标小分子的色譜峰圖

 

1.3 标準曲線

通過預實驗檢測樣本目标分子MRM信号,預估目标分子大概濃度範圍,以估算濃度點為中間值,左右再選擇合适的濃度點共8個濃度點建立濃度-峰面積響應标準曲線,每個濃度點3次重複。通過标準曲線,對樣本中目标分子進行絕對濃度定量。

屏幕快照 2018-05-14 下午4

圖3 目标分子标準曲線拟合

橫坐标為分子濃度值,縱坐标為質譜響應值。

 


1.4 LOD(最低檢測下限)和LOQ(最低定量下限)

通過标準品的檢測結果,評估LC-MRM方法檢測目标分子的LOD和LOQ。

  屏幕快照 2018-05-14 下午4

圖4 LOD

橫坐标時間,縱坐标為強度值

      屏幕快照 2018-05-14 下午4

圖5 LOQ

同圖4

 

2、樣本檢測

根據前期實驗建立好的方法,開展具體樣本的目标分子定量檢測。

屏幕快照 2018-05-14 下午4

圖6 目标分子的色譜圖

                                       

 




1、代謝樣品

一般不推薦客戶送提取好的代謝物樣進行檢測,如果客戶确已提取好了,需送代謝物樣本進行預實驗檢測。

 

2、代謝組織樣品

表1 代謝組織類樣品送樣要求

樣品類型

送樣量

備注

組織(動植物)

≥100mg

總重量最低不低于50mg

酵母、黴菌類真菌和細菌等微生物

≥10mg;菌液≥20µL;細胞個數≥107個

必須經過淬滅(即将微生物迅速用液氮或者有機溶劑(-40℃)滅活,使其代謝瞬間停止)

生物體液(血漿、血清)

≥200 µL

總體積最低不低于100 µL;血漿為采用抗凝劑抗凝後, 除去血細胞的液體;血清為血液凝固後的上清液

生物體液(尿液)

≥1mL

總體積最低不低于200 µL;尿液需新鮮,未做任何處理

糞便

≥100mg

不能有糞便儲存液,直接-80℃凍存

*所有樣本均需在采集後,立即置入液氮中速凍,-80℃低溫冷凍保存,幹冰寄送;建議送樣量能滿足實驗的所有測試需求,最低送樣量有一定風險,具體是最終實驗結果為準。

 

3、客戶選定的目标小分子,需要随樣本同時寄送相應标準品至華大。推薦采購sigma公司的标準品。


Q1:如何選擇母子離子對?

A1:一個母離子可能對應多個子離子,在實驗方法建立過程中,每個目标化合物會提供兩個最佳母子離子對,其中一個用于定性,同時會根據标準品的色譜保留時間排除假陽性結果。

Q2:标準曲線如何制作?

A2:選取不同濃度的标準品溶液(默認8個點),根據标準品濃度和标準品MRM信号響應峰面積拟合直線方程。得到标準曲線。

Q3:MRM技術進行質譜時,可以一次監測多少個母子離子對?是隻能對一個特定分子監測,還是多個特定分子同時監測?

A3:MRM檢測可實現多個目标分子的同時檢測,最大限度節省時間,提高檢測效率,每個工作循環最多能處理300對母子離子對,使用Schedule MRM可達700對母子離子對。

Q4:MRM在做定量方面有哪些優勢?

A4:高通量:能實現大規模樣本的定量分析;高靈敏度:定向分析,排除背景噪音幹擾;準确度高,重現性好。

Q5:華大如何減少實驗誤差,提供數據的質量?

A5:會在實驗過程加入内标校正實驗誤差,并為客戶提供嚴格的QC質控确保數據的真實可靠.

Q6:是否需要提供同位素内标的标準品?

A6:同位素内标能校正實驗誤差,可以提供準确的定量結果,是目前絕對定量普遍采用的實驗策略;也可根據客戶需求合理設置其它内标,減少實驗誤差。


深圳華大科技(總部)

電話:400-706-6615
郵箱:info@genomics.cn