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  • 首頁蛋白修飾分析

蛋白修飾分析

      蛋白翻譯後修飾(Post-translational modification, PTM)指蛋白經生物合成後的共價修飾及酶學修飾,修飾作用可發生在蛋白氨基酸側鍊及其C或N末端,通過對現有20種氨基酸官能團的改造或者引入新的基團(如磷酸基、乙酰基等)來實現其功能的擴展,大多數真核生物所表達的蛋白質需經過一系列的翻譯後加工和修飾才能形成最終複雜的功能執行體,因此蛋白質的翻譯後修飾成為蛋白質組學研究的重要方面。

      由于翻譯後修飾蛋白質在樣本中含量低且動态範圍廣,其相關研究極具挑戰性,親和富集、多維分離等技術與生物質譜的結合為翻譯後修飾蛋白質組學的發展提供了契機。目前,已進行規模化研究的蛋白修飾主要有磷酸化(Phosphorylation)、乙酰化(Acetylation)、糖基化(Glycosylation)、泛素化(Ubiquitination)等。

蛋白修飾類産品名稱

産品細分

産品優勢

蛋白磷酸化修飾分析

Ser/Thr-P鑒定

采用高效富集策略,iTRAQ精準定量,更有motif和激酶預測分析

Ser/Thr-P-iTRAQ标記定量

Tyr-P鑒定

酪氨酸磷酸化蛋白鑒定數高,達文獻中上水平;重複性好,平均可達60%;質控嚴格。

Tyr-P定量

蛋白乙酰化修飾分析

Ace-K鑒定

乙酰化蛋白鑒定數高,達文獻中上水平;重複性好,平均可達80%;質控嚴格。

Ace-K定量

N-糖基化修飾分析

鑒定

适用于大多數樣品的N糖基化肽段鑒定已達到文獻中上水平;重複性好,平均可達60%以上;質控嚴格。

定量

蛋白修飾定量驗證工具

PRM靶向定量-磷酸化

采用“full MS+PRM”;PRM list導出成功率高;操作便捷穩定,省去碰撞能量(CE)優化;定量更準确,含更豐富的母離子和子離子信息輔助定量;質控嚴格,定量時樣品間内參磷酸肽的CV小于25%。

     (1)蛋白磷酸化修飾全譜鑒定

      蛋白磷酸化修飾全譜鑒定是以組織、細胞為研究對象,目的在于鑒定樣品中磷酸化修飾蛋白質以及相應的磷酸化修飾位點。先對樣品進行酶解、富集修飾肽段(可選),然後用質譜(LC-MS/MS)進行檢測,利用得到的質譜圖與數據庫搜索比較,從而鑒定蛋白質修飾位點,結合信息分析手段闡述修飾蛋白質的生理意義及生物意義。單個蛋白修飾鑒定是指對經過分離純化、純度較高的目标蛋白質(目标蛋白質純度>80%)進行質譜鑒定,檢測目标蛋白質的修飾位點。

      技術路線

T1

圖 1 修飾蛋白(全譜)鑒定技術路線

      (2)蛋白磷酸化修飾iTRAQ定量

      蛋白磷酸化修飾iTRAQ定量是基于高精度、高靈敏度質譜儀,将iTRAQ定量技術與TiO2富集技術相結合,對生物體的修飾蛋白進行鑒定并相對定量,從而達到研究生物體内修飾蛋白質組動态變化與集體表型改變之間關系的目的。

      技術路線

111

圖 2 修飾蛋白定量技術路線

     (3)磷酸化PRM定量分析

      PRM(parallel reaction monitoring),平行反應監測技術,通過串聯質譜,有目的的篩選目标蛋白肽段進行定量的靶向蛋白質組研究策略之一。PRM和MRM(multiple reaction monitoring,或SRM,selected reaction monitoring)技術類似,都可作為目标蛋白定量研究策略,需要先通過一級質譜将目标蛋白的肽段篩選出來,不同的是,在二級質譜時,PRM會将目标肽段所有碎裂的子離子信号進行采集,而MRM隻采集篩選到的特定子離子信号,通過液質聯用(LC-MS/MS)的方式,主要對感興趣的磷酸化修飾蛋白進行定量驗證。

      技術路線

T3

圖 3  PRM靶向定量技術路線

産品應用

T4

信息分析内容

信息分析條款

信息分析内容

标準信息分析

1 标準信息分析内容

1.1 數據産出統計

1.2 修飾位點鑒定

1.3 修飾肽段和修飾蛋白質鑒定

2 修飾蛋白組定量

2.1 差異修飾肽段統計(蛋白磷酸化全譜不适用)

2.2 差異修飾肽段的表達聚類(蛋白磷酸化全譜不适用)

2.3 定量重複性評估(僅針對設計了重複的實驗)

3 修飾蛋白功能分析

3.1 修飾蛋白質GO注釋

3.2 修飾蛋白質COG注釋

3.3 修飾蛋白質Pathway代謝通路注釋

3.4 差異修飾蛋白的GO富集分析(蛋白磷酸化全譜不适用)

3.5 差異修飾蛋白的Pathway富集分析(蛋白磷酸化全譜不适用)

定制化信息分析

4 磷酸化蛋白個性化分析

4.1 磷酸化位點motif分析(不限物種)

4.2 磷酸化位點功能注釋(主要匹配磷酸化位點數據庫,人物種會注釋充分,其他物種注釋效果更少)









1、用靶向高分辨率質譜法對人類磷酸化蛋白質組學進行即插即用分析。

Plug-and-play analysis of the human phosphoproteome by targeted high-resolution mass spectrometry. Nat. Methods. 2016

研究背景:研究細胞信号的系統方法要求磷酸化蛋白質組學技術能夠在多個重複、條件和時間點上測量相同的磷酸化多肽。

實驗樣本:MCF7乳腺癌細胞

信息分析:Skyline20、Comet21、DIA-Umpire24

質譜儀:Q-Exactive Plus

實驗結果:

T1

圖1 一種用于靶向人類磷蛋白分析的數據庫

a:數據分析路徑(在線方法)和彙總統計;b:單次試驗(n = 388)與深度分餾實驗(n = 50)中确定的磷酸化肽段比較;c:磷酸化肽段在實驗中的重複性;d:卵裂形式特異性(最常見的卵裂狀态/總計數)和分布;e:電荷狀态特異性(最常見的電荷狀态/總計數)和分布。

T2

圖2 即插即用分析展示

a:保留時間預測的性能;b:磷酸化肽段序列(n = 100)和電荷狀态(n = 50)選擇性能;c:PRM、DIA和DDA對IGF-1 EGF過礬酸鈉處理的MCF7細胞中純化的磷酸化肽段101個靶點的分析;d:對T308 / T309和S473 / S474(n = 6)靶向位點特異性和異構形式特異性定量AKT1/2磷酸化。

2、酪氨酸磷酸化分析用于肉瘤細胞系研究

Phosphoproteomic profiling reveals ALK and MET as novel actionable targets across synovial sarcoma subtypes. Cancer Res. 2017

研究背景:盡管肉瘤有多種治療方式,但從結締組織中産生的惡性腫瘤依然具備很多亞種,生存率極低。

技術手段:文章采用基于質譜的磷酸化蛋白全譜的方法,對迄今為止最大種類最多的肉瘤細胞系進行表征,鑒定到新的酪氨酸磷酸化形式,在特殊的亞型中酪氨酸激酶活性增強,作為驅動激酶可作為治療的候選靶點。

實驗樣品:尤文氏肉瘤(ES),血管肉瘤(AS),滑膜肉瘤(SS),橫紋肌肉瘤(RMS),胃腸道間質瘤(GIST)細胞系;20mg;

質譜儀:Thermo Fisher Scientific Orbitrap Plus ;Maxquant

實驗結果:得到1090個酪氨酸磷酸化肽段,654個蛋白;基于酪氨酸磷酸化全譜,通過無監督的聚類分析,細胞系分為3大類;

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圖3 肉瘤細胞系的酪氨酸磷酸化分析

A:基于酪氨酸磷酸化模式的肉瘤細胞系無監督分層聚類;B:蛋白質-蛋白質網絡分析子群A揭示PTK2 (FAK)作為關鍵介質;C:使用酪氨酸激酶衍生的磷酸化多肽無監督分層聚類。

T4

圖4 酪氨酸激酶在肉瘤細胞系中的酪氨酸磷酸化

A:個别酪氨酸激酶對總磷酸化多肽豐度的貢獻;B:肉瘤細胞系中特異性TKs的磷酸化展示;C:SS細胞系中ALK表達和磷酸化。

3、人類細胞蛋白組學乙酰化全譜

Proteome-wide acetylationdynamics in human cells. Sci Reprots. 2017

研究背景:蛋白質乙酰化在調控蛋白功能和特性方面起到重要作用,研究乙酰化的動态範圍有助于了解修飾對蛋白穩定性、定位和功能的影響。

研究思路:

T5

圖5 代謝标記和工作流程

實驗樣品:Hela加入13C葡萄糖、D3-醋酸鹽培養取8個時間點(0.5, 1, 4, 8, 12, 16, and 24 hours)

質譜儀:Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer

實驗結果:通過該平台,對大約1000個位點進行了表征,根據乙酰化速率聚集鑒定出這些位點的乙酰化趨勢顯著增加。

表1 乙酰化鑒定數

表1

T6

圖6 重乙酰化聚類趨勢

A:熱圖顯示每一個時間點上13C/(13C+12C)的比例,在13C-葡萄糖标記的實驗中有統計學意義的重乙酰化;B:熱圖顯示每一個時間點上的13C/(13C+12C)比例,在D3-醋酸鹽标記實驗中有統計學意義的重乙酰化作用。

4、首次基于全細胞蛋白質組和賴氨酸乙酰化對紅色毛藓菌菌絲和分生孢子階段的比較。

The first whole-cell proteome- and lysine-acetylome-based comparison between Trichophyton rubrum conidial and mycelial stages. J. Proteome Res. 2018

研究背景:紅色毛藓菌作為最常見的真菌病原體及皮膚真菌感染研究最多的模式菌,但是目前所有的抗菌治療對其作用仍不是很明顯。

技術手段:該研究通過對紅色毛藓菌兩個生命階段蛋白質組及乙酰化蛋白全譜進行對比,分析出兩個時期的差異蛋白進而鑒定表征出其生理差異,為後續靶向治療提供理論參考依據。

研究思路:

T7

圖7 紅色毛藓菌賴氨酸乙酰化研究流程

實驗樣品:紅色毛藓菌菌絲和分生孢子

信息分析: MaxQuant

質譜儀:Q ExactiveTM

實驗結果: 兩個時期蛋白質組總共鑒定出4343個蛋白,其中有1879個差異蛋白;分生孢子期鑒定出386個修飾位點,285個蛋白,菌絲期鑒定出5414個修飾位點,2335個蛋白。

T8


圖8 GO豐富蛋白在全細胞蛋白質組分析

A:分生孢子特定蛋白GO富集;B:菌絲特定蛋白GO富集;C:差異表達蛋白GO富集。

圖9

圖9 基于KEGG富集的乙酰化和琥珀酰化修飾的關系熱圖

顔色代表每種類型的通道的富集(紅色)或耗盡(綠色)。

5、人血清中可溶性Fcγ受體Ⅲb的位點特異性N-糖基化分析。

Site-specific N-glycosylation analysis of soluble Fcγ receptor Ⅲb in human serum. Sci Rep 2018

研究背景:Fcγ受體在免疫系統中為免疫球蛋白G調節着各種效應及調控機制,N-糖基化的Fcγ受體很大程度的影響着免疫系統的功能。盡管已有研究報導描述重組FcγRⅢb糖蛋白的糖基化結構,但是關于其原有糖鍊異質體仍不是很了解。

技術手段:本研究基于質譜對一種從人體血清内純化的FcγRⅢb的可溶性形态進行了位點特異性的N-糖基化分析。

研究思路:FcγRⅢb純化——酶解富集糖肽——位點特異性糖基化質譜分析

實驗樣品:人類血清

信息分析: GlycoMod

質譜儀:Q ExactiveTM, Nanospray Flex Ion Source

實驗結果:數據結果顯示在每個N-糖基化位點的糖鍊異質體與之前所報導的重組FcγRⅢb糖蛋白具一緻趨勢,同時發現45号位天冬酰胺被高甘露糖類型低聚糖特異性占有。

T10

圖10 血清sFcγRⅢb位點特異性糖鍊異質體質譜圖譜

覆蓋6個N-糖基化位點,分别為(A) Asn38, (B) Asn45, (C) Asn64, (D) Asn74, (E) Asn162, and (F) Asn169。

表2 人血清sFc-RⅢb的N-糖基化位點的主要糖基形式

表2

6、蛋白組學和泛素化蛋白全譜分析分析揭示了泛素化在矮牽牛花蛋白降解中的作用。

Proteomes and Ubiquitylomes Analysis Reveals the Involvement of Ubiquitination in Protein Degradation in Petunias. Plant Physiol. 2017

研究背景:花瓣衰老作為一個複雜的程序化過程,通過使用一種植物激素——乙烯進行處理便可引發衰老發生,這一過程能極大的改變植物中轉錄組及蛋白質組表達譜。但是,乙烯對後轉錄修飾或者泛素化在後轉錄修飾及蛋白質組的影響知之甚少。

技術手段:該研究首先通過RNA測序獲得了矮牽牛花轉錄組數據,然後再定量經乙烯處理矮牽牛花花冠的蛋白質組、泛素化蛋白質全譜及兩者之間的聯系。

研究思路:

T11

圖11 經乙烯處理的矮牽牛花花冠全蛋白質組和泛素組的定量分析工作流程

實驗樣品:矮牽牛花

信息分析: GlycoMod

質譜儀:Q ExactiveTM, Nanospray Flex Ion Source

實驗結果:經乙烯處理16個小時的矮牽牛花,鑒定出51799條功能基因,3606個蛋白以及2270個泛素化位點;其中14448下調基因6303上調基因,284下調233上調蛋白,320上調127下調泛素化位點。

T12

圖12 矮牽牛花所有賴氨酸泛素化位點分析圖譜

A:泛素化序列及Kub保守位點;B:每個序列中包含泛素化賴氨酸所鑒定肽段數目;C:泛素化位點氨基酸性質;D:近Kub位點蛋白二級結構預測;E:在選擇的真核生物中,泛素化和非泛素化的賴氨酸的進化保護。

T13

圖13 乙烯對矮牽牛花乙烯合成及信号轉導路徑中蛋白的影響

本研究中基于統計學意義的差異表達蛋白被框在橢圓形框中,而不同的泛素化和磷酸化蛋白質框在圓形框中。紅色方框表示上調,綠色方框表示下調,而藍色表示對乙烯的處理沒有顯著變化。







1、定性結果展示

(1) 對于鑒定到磷酸化肽段,本項目利用磷酸化位點鑒定phosphoRS>0.75進行過濾。對于真核生物,蛋白磷酸化通常會發生在絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)上,其參與的生物學過程不太相同,發生比例也不一樣。

T1

圖1 肽段磷酸化位點數分布(a)及磷酸化修飾氨基酸殘基分布(b)

(2)磷酸化蛋白GO注釋:

      Geno Ontology(簡稱GO)是一個國際标準化的基因功能分類系統,提供了一套動态更新的标準詞彙表(Controlled Vocabulary)來全面描述生物體中基因和基因産物的屬性。GO總共有三個本體(Ontology),分别描述基因的分子功能(Molecular Function)、細胞組成(Cellular Component)、參與的生物過程(Biological Process)。

T2

圖2 GO功能注釋圖

GO分類圖顯示了三個本體中所涉及到各條目的分布情況,不同顔色标記為三個本體中涉及到的各個條目。

(3)磷酸化蛋白COG注釋

      COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins 蛋白相鄰類的聚簇)是對蛋白質進行直系同源分類的數據庫。構成每個COG的蛋白都是被假定為來自于一個祖先蛋白,并且是orthologs或者是paralogs.Orthologs是指來自于不同物種的由垂直家系(物種形成)進化而來的蛋白,并且特異地保留與原始蛋白相同的功能。Paralogs是那些在一定物種中的來源于基因複制的蛋白,可能會進化出新的與原來有關的功能。該分析将鑒定到的蛋白質和COG數據庫進行比對,預測這些蛋白質可能的功能并對其做功能分類統計。

T3

圖3 COG注釋柱圖

縱坐标為COG分類條目,橫坐标為功能分類對應的蛋白數量,該圖表示樣品中不同功能的蛋白質的統計數量。

(4)KEGG代謝通路注釋分析

      在生物體内,不同蛋白相互協調行使其生物學行為,基于Pathway的分析有助于更進一步了解其生物學功能。KEGG是有關Pathway的主要公共數據庫(Kanehisa,2008),通過Pathway分析能确定蛋白質參與的最主要生化代謝途徑和信号轉導途徑。

T4

  圖4 Pathway Map

紅框表明有鑒定到的蛋白在該節點發揮作用。

2、定量結果展示

(1)磷酸化蛋白組定量

      磷酸化肽段定量火山圖。橫軸為肽段定量值(log2化),縱軸為統計檢驗的P-value(-log化);分布在該火山圖左上右上兩區域的肽段為顯著差異肽段,既滿足差異倍數大于1.5或小于2/3,又滿足統計檢驗P-value值小于0.05。

T5

圖5 磷酸化肽段定量火山圖

表1  差異磷酸化肽段數目統計

B1

(2) 定量重複性評估

      變異系數(Coefficient of Variation)是衡量各觀測值變異程度的一個統計量,其計算公式為:變異系數 C·V =(标準偏差SD/平均值Mean)× 100%;一般來說,CV值越高,其觀測值離散程度越大,重複性卻差;反之CV越小,離散程度越小, 重複性越好。該圖中橫軸為CV範圍,10%表示CV在0~10%以内的部分, 20%表示CV在10%~20%以内的部分,以此類推。縱軸左側單位具體肽段數目,右側單位為比例。

T6

圖6 磷酸化肽段定量變異系數(CV)分布圖

(3) motif分析

      ⼀類磷酸化激酶能對有相同序列的蛋白進行磷酸化。如AKT激酶能對"R--s"序列的蛋白進行磷酸化。利用motif-X進行修飾位點所在序列的motif提取,能推出蛋白對應的磷酸化激酶。

T7

圖7 某個磷酸化肽段motif圖

(4)激酶-底物分析

      ⼈基因組注釋信息告訴我們,⼈類存有518個激酶,主要分為9個組:AGC(蛋白激酶A、G、C組)、Atypical(非典型組)、CAMK(鈣調節激酶組)、CK1(酪蛋白激酶組)、CMGC(蛋白激酶CDK, MAPK, GSK3、CLK組)、STE(酵母STE7、11、20同源基因激酶組)、TK(酪氨酸激酶組)、TKL(類酪氨酸激酶組)和其他,90個家族、145個亞族。不同家族偏向有不⼀樣的功能。

T4

圖8 ⼈類激酶組









表1 組織類樣品送樣要求

樣品類型

送樣量

備注

動物組織

≥300mg

富含雜質或蛋白質含量低的樣品量幹重,如植物的根、木質部、韌皮部組織等需适當增加送樣量,具體需評估後确定。

植物、蕈類真菌(如蘑菇、木耳)、藻類

≥3g

酵母、黴菌類真菌和細菌、噬菌體等微生物

≥600mg(菌體約60µL)

新鮮培養細胞數(個)

≥1×107(細胞沉澱體積約60~100µL)

/

血液類

血清、血漿≥500µL;全血 ≥15mL

解凍後血細胞會破裂,蛋白溶出來會影響分析,因此一般不建議送全血;如直接送提取好的蛋白,請去除高豐度,并附上去除高豐度前後的膠圖。

表2 蛋白類樣品送樣要求

服務類型    

蛋白

修飾蛋白全譜鑒定

富集分組分

≥10mg

單個修飾蛋白鑒定

富集

>30µg,目标蛋白純度>80%

iTRAQ修飾蛋白定量

富集

≥1.5mg,濃度≥1µg/µL

PRM靶向定量-磷酸化

富集

≥1.5mg,濃度≥1µg/µL





Q1:磷酸化位點是如何确定的?

A1:一種特定的翻譯後修飾通常會作用于一定的氨基酸,經修飾後,這一類氨基酸會增加相同的分子量,如,磷酸化肽段因加入磷酸化基團而産生+80的質量偏移。基于質量偏移的理論,利用生物信息學方法可以分析質譜數據鑒定磷酸化翻譯後修飾。


Q2:磷酸化蛋白質組富集策略有哪些?如何選擇?

A2: 對于磷酸化蛋白的分離富集

1)抗體富集法:就是用識别磷酸化氨基酸殘基的特異抗體進行免疫共沉澱,從複雜混合物中免疫沉澱目标蛋白質,是最簡單的方法;

2)激酶特異富集法:利用小分子的磷酸激酶抑制劑對其進行特異親和層析成為激酶磷酸化蛋白質組學研究的重要方法;

3)親和富集法:利用磷酸基團與一些金屬離子或金屬氧化物等的親和作用,實現對磷酸化蛋白的富集。

對于磷酸化肽段的分離富集

1)化學修飾富集法:用親和試劑取代磷酸化肽段上的磷酸集團, 再用親和提取的方法從混合肽段中分離磷酸化肽段, 是一種有效的化學修飾法;

2)色譜分離富集法:包括IMAC富集法、金屬氧化物(如TiO2等)和金屬氫氧化物富集方法、陰陽離子交換富集法以及親水性相互作用色譜法等;

3)MALDI靶盤富集法:為了滿足對磷酸化蛋白的高通量分析以及微量樣品的分析, 可以采用在線富集後直接質譜鑒定的方法。利用MALDI靶盤可實現直接在線富集檢測。

據文獻報道酪氨酸磷酸化比例最少,僅占整體磷酸化肽段的1%,如果實驗目的隻關注酪氨酸磷酸化的變化時,建議選擇酪氨酸磷酸化抗體進行富集。如果實驗關注的是非酪氨酸,或者是所有可以發生磷酸化的氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸),由于抗絲、蘇氨酸磷酸化抗體抗原決定簇較小,使得抗原抗體的結合位點村長空間障礙,特異性較差,所以建議選擇IMAC或TiO2富集。

 

Q3:華大科技用于磷酸化富集的方法是什麼?

A3:華大科技選用的是TiO2富集法,它是目前最為成熟的金屬氧化物磷酸化肽富集法TiO2在不同的pH值下,可以表現為路易斯酸或路易斯堿。在酸性條件下,钛原子帶正電表現為路易斯酸,可以與陰離子結合;在堿性條件下,則表現為路易斯堿,可以與陽離子結合。這樣磷酸化肽段的磷酸基在酸性條件下與之結合,堿性條件下洗脫,達到富集磷酸化肽段的目的。



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