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長鍊非編碼 RNA 測序

      LncRNA高通量測序,采用去核糖體鍊特異性建庫方法,對長鍊非編碼 RNA、mRNA 、環狀RNA等大RNA進行測序研究,從而快速全面準确地獲得與特定生物學過程(例如發育、疾病等)所有大RNA轉錄本數據信息,可應用于細胞分化和發育的研究、調控機理的研究、疾病标志物的尋找、疾病的分子診斷、基因藥物的研發等。                                                                                                                             圖片1


産品優勢

1. 豐富的項目經驗

華大首推lncRNA産品,已完成10000+樣品;

2. 精湛的技術工藝

樣品起始量低至200ng,且可承接人、鼠、動植物樣品、FFPE樣品;

3. 軟件更新,分析結果值得信賴

新增編碼能力預測軟件(CNCI)和數據庫(Pfam),多種預測方法取交并集,結果更加可靠;

4. 數據庫升級,緊跟科研前沿最新信息

采用NOCODE、KEGG數據庫最新版本,新增GREENC 植物lncRNA數據庫(包含38種植物和7種藻類lncRNA數據);

數據深入挖掘,一次測序即可獲得mRNA和lncRNA、circRNA及關聯數據分析結果

包含mRNA定量&注釋&功能結構分析,lncRNA靶基因及功能分析,circRNA預測及功能分析, 以及lncRNA-mRNA互作結果可視化,可直接用于文章撰寫;

5. 結果展現清晰,讓您省時省力省心

1)mRNA &lncRNA 已知及未知部分定量結果分别統計

2)mRNA &lncRNA表達差異分析:樣本間/組間分别統計

3)mRNA &lncRNA表達聚類及差異聚類分别統計

4)lncRNA功能注釋結果集合,方便結果查閱

6. 無憂解決售後

據客戶需求進行貼身個性化服務,為文章撰寫提供技術服務。

7. 嚴格的質量管理

實驗全程采用全方位質控體系,應用質量管理體系金标準。

8. 貼心的售後支持

7*24小時全天候技術支持,第一時間響應客戶需求。

産品應用

1. 細胞分化和發育調控機理的研究

2. 疾病标志物的尋找

3. 疾病的分子診斷

4. 基因藥物的研發

信息分析内容

1. 标準信息分析

(1) 基本數據統計:

① 去除接頭序列、低質量序列得到clean data

② 與核糖體數據庫比對,去除核糖體RNA數據

(2) lncRNA & mRNA鑒定

① 轉錄本組裝

② 鑒定已知轉錄本(包括已知lncRNA,mRNA)

③ 預測新轉錄本(包括新的lncRNA,mRNA)

(3) lncRNA & mRNA定量分析

① 已知和新的lncRNA & mRNA定量分析

② 樣本間差異分析(至少2個樣本)

③ 組間差異分析(至少2組樣本,每組至少3個生物學重複)

④ lncRNA & mRNA 表達/差異表達聚類分析

⑤ lncRNA & mRNA 表達時間序列分析(至少需要3個時間點的樣本,或者3種不同

處理方式的樣本)

(4) lncRNA功能預測

① lncRNA靶基因預測

② miRNA前體預測

③ lncRNA家族預測

(5) mRNA功能注釋

① 數據庫注釋

② 差異表達mRNA的GO和Pathway富集分析

(6) mRNA結構分析

① 可變剪切分析

② SNP/Indel分析

2. 高級分析

(1) lncRNA靶基因GO和Pathway富集分析

(2) lncRNA及靶基因互作網絡分析


華大lncRNA biomarker研究——鑒定細胞遺傳學正常的急性骨髓白血病有效biomarker

                                                                                           Haematologica. 2017 Oct;102(10):1718-1726.

研究目的:尋找細胞遺傳學正常的急性骨髓白血病鑒定有效biomarker

研究樣本:40例細胞遺傳學正常的急性髓樣白血病患者樣本測序;134個樣本進行驗證

研究技術:去核糖體、鍊特異性建庫測序

研究結果:對11036個lncRNA進行定量,其中大于8000個為新lncRNA。通過聚類方法分析(Using unsupervised analysis),發現一個突變基因NPM1表達的特殊lncRNA. 且通過數據統計分析發現有突變NPM1基因患者和無突變的對照組表達差異的12個lncRNA,并通過Qrt-PCR對135個獨立患者進行定量驗證。另外,鑒定到NPM1基因突變患者中一個顯著低表達biomarker- XLOC_109948。 

研究思路:

                            F1


詳細結果:

1、使用分層聚類無監督分析手段,對11036個lncRNA進行分類研究,主要可分為兩大類(見圖1);在小群體(40例)和大群體(134例)中都有顯著分類情況,說明NPM1突變的病人lncRNA表達差異顯著。

                                        案例圖1

2、為縮小鑒定特異性lncRNA範圍,使用Sparse PLS-DA方法,對31個顯著差異表達的lncRNA進一步分析,鑒定12個lncRNA可用于區分NPM1突變病人和非突變病人。在40例和134例患者中都可進行區分(見圖2)。

                                      案例圖2

3、為進一步尋找可靠biomarker,使用ROC生存曲線方法對每一種lncRNA進行驗證,發現隻有XLOC_005798和XLOC_109948在40例樣本中可作為較好的biomarker,能夠通過總生存數和無病生存率數據直接進行區分。在134個樣本中進行驗證,驗證發現XLOC_109948能夠有效區分。低表達XLOC_109948的病人有較高存活率,高表達則較低存活率(見圖3B)。

                                   案例圖片3




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表1  lncRNA組織樣品送樣建議

組織類型

具體要求

新鮮培養細胞(細胞數)

≥2×105 cell

新鮮動物組織幹重

≥30 mg

全血

≥1 mL 全血收集的淋巴細胞

≥1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血

菌體(細胞數或幹重)

≥2×10cell or ≥30 mg

FFPE

≥5片,未染色,100 mm2,5-10 μm厚度


表2  lncRNA測序樣品判定标準

樣本類型

總量

濃度

RIN

28S/18S

基線和 5S

純度

Total RNA
(Animals)

≥1 μg

≥40 ng/μL

RIN≥7.0

28S/18S≥1.0

基線平整,5S 峰正常

無 DNA,蛋白/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

Total RNA
(Fungi)

≥1 μg

≥40 ng/μL

RIN≥6.5

28S/18S≥1.0

Total RNA
(human/Rat)

≥200ng

≥20 ng/μL

RIN≥7.0

23S/16S≥1.0

FFPE RNA

≥1 μg

≥70 ng/μL

RIN≥2.0

DV200≥30%

Total RNA (Insect)

≥1 μg≥40 ng/μLNA



Q1:什麼是長鍊非編碼RNA?以及它們的作用?

哺乳動物基因組序列的約5%~10%被穩定轉錄,蛋白質編碼基因僅約占1%,其餘4%~9%的序列都轉錄為非編碼RNA。而非編碼RNA(non-coding RNA) 是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子。長鍊非編碼RNA為這4%~9%中長度大于200nt的非編碼RNA。它們的作用主要體現在四個方面:第一,影響周邊基因的表達;第二,調控蛋白質活動及定位;第三,産生小分子RNA;第四,對其他RNA的調控作用[1]。

Q2:長鍊非編碼RNA的建庫方案是什麼?

長非編碼RNA建庫主要采用去除rRNA,構建鍊特異性文庫,目前建庫比較穩定。适用于人、鼠、動植物等物種。

Q3:長鍊非編碼RNA主要簽約風險有哪些?

rRNA去除效率不穩定,rRNA比例可能較高;隻去除rRNA較适用于有良好參考基因組的項目,後續可以通過比對區分編碼和非編碼序列。

Q4:在信息分析中主要運用到的軟件有哪些?

Tophat和Cufflinks(構建轉錄本),Infernal(家族分類),CPC(對轉錄本編碼能力進行預測),Blast(比對),SOAP(過濾實驗中未去除幹淨的rRNA,及lncRNA表達定量比對)。

Q5:長鍊非編碼RNA建庫測序結果可以用于分析環狀RNA嗎?

可以,長鍊非編碼RNA建庫模式采用去核糖體方式建庫,對所獲得的RNA進行打斷測序,相當于獲得全部RNA,即可以進行分析環狀RNA表達情況,可應用于分析各物種環狀RNA表達譜。

Q6:LncRNA測序數據中mRNA的定量效果如何?

人标品:已知mRNA定量與qPCR定量斯皮爾曼系數達到0.88。


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