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全基因組 Bisulfite 甲基化測序

産品簡介

        全基因組甲基化Bisulfite測序是DNA甲基化研究的黃金标準,它通過Bisulfite處理和全基因組DNA測序結合的方式,對整個基因組上的甲基化情況進行分析,具有單堿基的分辨率,可精确評估單個C堿基的甲基化水平,覆蓋範圍廣。它可以構建精細甲基化圖譜,建立表觀遺傳學研究數據庫,為後續大規模開展不同樣品間的甲基化差異分析提供參考圖譜。

 技術流程


技術優勢

技術穩定性、重複性好:從樣本檢測到文庫構建、上機測序,每一步均有嚴格的标準操作Sop和對應的質控标準,保證每一個樣本都得到最真實的測序結果。

Bisulfite轉化率高:經過不斷優化建庫方案,華大的甲基化建庫BS平均轉化率高達99 %以上,作為文庫構建的質控指标進行嚴格控制。

單堿基分辨率:精确分析每一個C堿基的甲基化狀态。

準确性和可靠性高:準确區分甲基化的C和未甲基化的C。

檢測範圍廣:覆蓋全基因組範圍内的所有位點。

無偏向性:反映真實的甲基化狀态。

樣品起始量低:華大基因經過不斷的研發,樣本起始量不斷降低,最低可至pg級。

多組關聯分析:具有豐富多組學分析經驗,專項開發,可根據項目需求進行多個組學關聯分析。

經驗豐富:執行了上千個項目,數萬個樣本,合作發表文章一百多篇。

信息分析

1) 數據基本處理與質控

2) 全基因組甲基化水平分析

3) 甲基化C堿基中CG, CHG 與CHH的分布比例

4) 甲基化CG、CHG和CHH的甲基化水平分布

5) 甲基化的CG,CHG,CHH附近堿基的序列特征分析

6) 染色體水平的甲基化C堿基密度分布

7) 基因組不同轉錄元件中的DNA平均甲基化水平

8) 全基因組差異甲基化區域DMR的檢測

9) DMR相關基因的GO和Pathway分析

10)  其他定制化信息分析(可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析内容。)


案例一: DNA甲基化應用于液體活檢(血漿)鑒定早期腫瘤來源[1]

研究背景:近幾年研究發現癌症無創檢測技術通過液體活檢可篩選出死亡癌細胞釋放的ctDNA,從而能夠檢測癌症的早期發生,但卻不能得知早期癌症發生的具體位置,在該研究中,張鹍教授和他的團隊在血液中利用甲基化單倍型作為新的分子标記,不但可以準确檢測出數量極少的癌細胞,而且還可以識别癌細胞在組織中的來源,為了開發該癌症早期檢測方法,研究人員收集了10個不同組織(肝髒,肺等)的基因組數據,結合UCSD癌症中心癌症患者的腫瘤樣品和血液樣品數據進行分析,構建了不同組織癌症特異性甲基化标記數據庫,該文章的方法是腫瘤ctDNA液體活檢與甲基化檢測的全新結合,新的技術能幫助人們更早發現腫瘤的發生位置,意義遠大。

應用技術:WGBS、RRBS、基因分型芯片

數據來源:UCSD Moores癌症中心的癌症患者的腫瘤樣品和血液樣品,以構建癌症特異性遺傳标記的數據庫。

腫瘤Biomarker:cancer-associated highly methylated haplotype

文章思路:


圖1 文章研究思路圖解

突出成果:定義了新的腫瘤早篩Biomarker (DNA 甲基化單倍型),新的方法思路,确定腫瘤的來源問題,利用CfDNA進行預測鑒定,并進行準确性驗證。


圖2 基于MHL方法進行ctDNA癌症組織來源預測 

a. 組織特異性MHL在癌症患者的相應組織和血漿樣品中可見;b. WGBS和RRBS數據驗證MHB方法預測組織來源的準确性 c-将預測模型應用于腫瘤患者和健康個體的血漿樣本驗證。


案例二:人的年齡與DNA甲基化的相關性研究[2]

案例描述:利用WGBS技術比較了一位103歲老年男子和一名新生男嬰的DNA樣本,結果他們發現一個出現在1600多萬個位置上,幹擾了基因轉錄的甲基化修飾,在新生兒與百歲老人的細胞中是不一樣的。

發表單位:Bellvitge 生物醫學研究院, 巴塞羅那大學,華大基因

影響因子:9.681

案例流程:

wgbs2

研究成果:通過WGBS技術比較了一位103歲老年男子和一名新生男嬰的DNA樣本,并在大量樣本中進行了驗證,最終發現與同樣細胞類型的新生兒相比,整體上百歲老人DNA中有更多的非甲基化。

圖3 百歲老人(紅色)與新生兒(藍色)的甲基化分布

參考文獻

[1]    Guo S, Diep D, Plongthongkum N, et al. Identification of methylation haplotype blocks aids in deconvolution of heterogeneous tissue samples and tumor tissue-of-origin mapping from plasma DNA.[J]. Nature Genetics, 2017, 49(4):635.

[2] Holger Heyn et al. Distinct DNA methylomes of newborns and centenarians.PNAS, 2012, vol. 109 no. 26,10522–10527.


1、甲基化CG、CHG和CHH的甲基化水平分布

        不同類型的C堿基(mCG、mCHG和mCHH ),其甲基化水平在不同物種間,甚至同一物種不同細胞類型不同條件下其甲基化水平都存在差異。此圖統計每種類型( CG、CHG和CHH )甲基化C的甲基化水平分布,反映了該物種DNA甲基化特征。

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圖1 甲基化C位點的甲基化水平分布

2、甲基化的CG,CHG,CHH附近堿基的序列特征分析

        在一些真核生物中,甲基化位點附近堿基的序列特征,對反映甲基化發生的序列偏向有指導意義。為了研究序列特征與甲基化偏向性之間的聯系,我們計算了甲基化位點上下遊9個堿基 (mC位于第四個堿基)的甲基化百分比。

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圖2 mCG,mCHG,mCHH附近堿基的序列特征分析

3、染色體水平的甲基化C堿基密度分布

        有研究證明非CG型的甲基化與CG型甲基化C的密度有很大的差異。染色體亞端粒區域DNA甲基化水平通常較高,這一現象與端粒長度以及重組有十分重要的作用,此外還有基因表達和蛋白與DNA的相互作用都有緊密聯系。 如下圖的顯示,整體的甲基化水平圖譜顯示DNA甲基化的密度在整條染色體上變化很大。


圖3 各染色體上甲基化C的密度分布

4、基因組的不同區域的甲基化分布特征

        基因組的不同區域具有各自不同的甲基化模式,也行使着不同的生物學功能,下圖中以熱度圖的形式表示基因組各特征區域的甲基化水平情況,有助于進一步了解這些區域的甲基化特征。


圖4 基因組不同區域的甲基化分布,以及相應的CpG密度分布

5、基因組不同轉錄元件中的DNA平均甲基化水平

        為了深入地揭示DNA甲基化與基因表達的内在聯系,所有編碼基因序列被分成7種不同的轉錄元件區域,在此基礎上對不同轉錄元件區域的平均甲基化水平進行統計。DNA甲基化水平在不同功能區的分布特點有助于從全基因組水平去了解不同區域的DNA甲基化修飾的作用。


圖5 全基因組不同功能元件區域的甲基化平均水平分布

6、全基因組DMR的檢測

        差異甲基化區域(DMRs)是指不同樣品中基因組表現出不同的甲基化模式的某些DNA片段。 DMR與遺傳印記相關,在個體中表現為與父本或母本的甲基化狀态一緻。甲基化的等位基因經常表現為沉默狀态。親本與子代甲基化模式的差異常常導緻表觀遺傳缺陷,而人工繁殖技術可能會導緻異常甲基化的比例升高,并導緻疾病的發生。我們用滑動窗口的方法檢測DMR。在兩個樣品基因組相同位置上尋找包含至少5個CG(或CHG,或CHH)的窗口,比較該窗口在兩個樣品數據中甲基化水平的差異,尋找在兩個樣品中甲基化水平有差異的區域。


圖6 基因組DMRs中的甲基化水平分析

7、差異性甲基化區域(DMR)相關基因GO分析

        基因本體論(Gene ontology,GO)是所有物種中最主要的了解基因和基因産物屬性的生物信息學分析手段,GO分析能夠用于鑒定基因産物的性能,它包含了三類基因功能信息:細胞組分(Cellular Component),分子功能(Molecular Function)和生物學過程(Biological Process)。為了探讨表觀遺傳變異在通路和生物學過程中起到的作用,我們對DMR相關的基因進行了GO分析。

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圖7 DMR相關基因的GO聚類分析

8、差異性甲基化區域(DMR)相關基因Pathway分析

       KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有關Pathway的主要公共數據庫,該數據庫整合了基因組、化學以及系統功能信息,特别是測序得到的基因集與細胞、生物體以及生态環境的系統性功能相關聯。所有樣品中的DMR相關基因均用KEGG數據庫進行分析。

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圖8 DMR相關基因的Pathway功能顯著性富集分析


1、核酸樣本

表1 DNA送樣建議

送樣建議表

樣品純度:OD260/280 = 1.8~2.0,A260/A230≥1.6;沒有蛋白、多糖和RNA污染;

樣品完整性:DNA 無明顯降解,需提供凝膠電泳檢測膠圖;

樣品溶劑:建議樣品用高質量試劑盒提取,溶于ddH2O。确保溶劑内不含有影響酶活的酒精,苯酚,氯仿或其它有機溶劑。

2、血液樣本

送樣前處理:要求為全血樣本,并加入抗凝劑(非肝素),無血凝塊,冷凍後,幹冰運輸送樣。

樣品送樣标準:全血≥3ml,可得90G bp數據量。

3、組織樣本

樣品送樣标準:按照送樣建議做送樣前處理,每個樣本新鮮組織幹重≥2g,可得到90G bp的數據;如果樣本為非新鮮組織,DNA得率會降低,建議多送一些組織。


Q1: Bisulfite-Seq在項目開始之前需要考慮哪些因素?

Bisulfite-Seq在項目開始之前需要考慮以下因素:是否為低甲基化率的物種;該物種的基因組完成情況如何(影響BS-SEQ的比對);基因組是否存在複雜因素:GC含量偏高、雜合度偏高、轉座子、重複區域等。

Q2:可以對無參考基因組的物種進行Bisulfite研究嗎?

Bisulfite-Seq強烈依賴基因組的完成程度,基因質量的好壞直接影響後續的分析結果,因此更适合有完整基因組信息的物種。

Q3:如果合作夥伴自己建庫,能否提供上機測序?如何進行文庫質量檢測并保證測序質量?

合作夥伴自己建的文庫,可以上機測序。如果用标準的Illumina kit,要注明kit的類型及貨号。如果不是使用Illumina kit建庫,那麼合作夥伴提供信息單的同時必須說明建庫方法、使用的試劑盒及品牌,以及提供建庫所用的接頭引物序列和預期文庫片段大小。如果是index文庫,要注明index的位置以及index的序列。若隻完成部分建庫過程請務必注明清楚;如果文庫是PCR産物建庫或者插入片段中有特定序列,請在提供的樣品信息單中說明,否則會極大地影響數據質量。對合作夥伴文庫的檢測,首先用Agilent 2100 Bioanalyzer 确定片段大小是否符合;然後通過Q-PCR精确定量确定上機體積。

Q4:Bisulfite的轉化率是多少?

Bisulfite轉化率達到99%以上;如果樣品的DNA不存在不發生甲基化的DNA作為對照,都會在樣品中混入control DNA來驗證Bisulfite的轉化率。


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