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産品服務

Sequencing services

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真菌 de novo 測序

産品介紹

       真菌的基因組通常較大且複雜,傳統的技術無法滿足真菌全基因研究的大數據量需求,目前采用二三代測序聯合組裝的策略可實現真菌精細圖組裝,某些項目可組裝到接近完成圖水平,為真菌的研究提供強有力的支撐,可用于預測真菌的重要基因和蛋白以了解其功能和可能機制;在研究植物緻病性真菌方面,可以鑒定緻病真菌與農作物互作及緻病的相關基因,并可用于研究與其近緣物種的進化關系,比較基因組研究等;在食用真菌和藥用真菌的研究方面,可以用于發現真菌複雜的代謝途徑,鑒定其對人有益的代謝産物,及物種進化關系的研究,比較基因組等;另外還可用于生物防治真菌的研究,工業酵母菌的研究等。

産品優勢

組裝指标高:二三代聯合組裝,承諾指标業内最高(contig N50≥2M)

經驗豐富:已完成數千個真菌de novo項目,發表真菌基因組文章50多篇。

優質服務:基于豐富的項目經驗,針對客戶需求提供最優的解決方案

研究方法

測序策略

小片段文庫

10Kb/20Kb mate-pair文庫

PacBio 20Kb文庫

真菌denovo

初級組裝

50X

高級組裝

50X

50X(可選)

60X~90X

 信息分析内容

信息分析條款

信息分析内容

基因組組分分析

  • 基因成分
  • 重複序列
  • 非編碼RNA預測

基因功能分析

  • 通用功能注釋(默認KEGG, SwissProt, GO, 可選NrCOG
  • 病原真菌緻病性研究
  1. 病原與宿主互作數據庫(PHI)注釋
  2. 碳水化合物相關酶(CAZy)數據庫注釋
  3. 細胞色素P450數據庫注釋
  4. 分泌蛋白預測
  5. 轉錄因子注釋(個性化分析)
  6. 轉運蛋白注釋(個性化分析)
  7. 蛋白激酶預測(個性化分析)

比較基因組分析(需要參考序列)

  • 結構變異(共線性)
  • 共有基因和特有基因
  • 物種進化(基于共有基因和特有基因或基因家族構建系統進化樹)
  • 基因家族

定制化分析

  • 可結合客戶的需求,協商确定信息分析内容


案例一:大麗輪枝菌基因組研究

Comparative genomics reveals cotton-specific virulence factors in flexible genomic regions in Verticillium dahliae and evidence of horizontal gene transfer from Fusarium(New Phytologist, IF=7.21)

       大麗輪枝菌Verticillium dahliae是一種廣泛危害農作物的半知菌亞門輪枝菌屬真菌,寄主多達660種,已成為一個世界性難題。不同的大麗輪枝菌有不同的原始宿主,如V.dahliae Vd991以棉花為原始寄主,它的兩個姐妹菌株V.dahliae JR2和V.dahliae VdLs.17原始寄主分别是番茄和莴苣。

       一般來說,大麗輪枝菌對原始寄主的适應性和毒力最高,對其他物種适應性和毒力相對較弱。不同菌株對宿主的适應性及毒力差異主要受染色體重組和種系特異性(lineage-specific, LS)基因區域影響。通過真菌denovo測序和比較基因組分析,發現V.dahliae Vd991的可變基因區存在棉花特異性的毒力因子,而一些棉花毒力相關基因很可能是從鐮刀菌屬(Fusarium)水平基因轉移獲得的。對目标菌株進行基因改造并進行毒力檢測,結果發現,Vd991對棉花的毒力與其特有的7個G-LSR2基因密切相關。

主要方法

1. Vd991真菌denovo測序及相關分析

      測序策略:三代測序(PacBio RSII)+ Miseq PE250+10Kb mate-paired文庫測序

      基因組分分析:基因預測、重複序列、非編碼RNA

      基因功能注釋:nr, eggNOGs,INTERPROSCAN (incorporating InterPro, GO and KEGG pathway annotation)

      毒力因子預測:CAZy、PHI、蛋白激酶(PKs)分析

      比較基因組分析:基因重排分析及PCR驗證、基因家族分析、進化分析

2. 三株V.dahliae真菌RNA-seq測序及相關分析

     建庫:TruSeqTM RNA Sample Preparation Kit

     測序:Illumina Hiseq 2000

     分析:基因表達差異分析、KEGG pathway分析

3. 真菌基因敲除、遺傳轉化實驗及菌株毒力實驗

主要結果:

1. LS基因可能是大麗輪枝菌對寄主适應性和緻病性差異産生的原因

      通過真菌denovo測序,得到高質量的V.dahliae Vd991基因組(genome size 34.8Mb, scaffold N50 951.7Kb),其中有33.9 Mb (> 97% genome size)區域與V.dahliae JR2和V.dahliae VdLs.17基因組具有高度共線性。然而,大量的LS基因的存在導緻V.dahliae不同菌株基因組分差異很大。V.dahliae Vd991基因組中許多LS基因主要富集在幾個狹窄的LSR(LS regions)。基因功能分析發現,LSRs很可能跟真菌的緻病性相關,另外由于這些區域附近有轉座子區域,導緻該區域變異性較高,進化速度較快。

真菌denovo圖1

圖1. 三株大麗輪枝菌的共有和特有基因。

真菌denovo圖2

圖2. 三株大麗輪枝菌共線性分析。各菌株均有特異性的LSR區。

 

2. Vd991的某些特異性基因區可能是從棉花枯萎病菌Fusarium基因水平轉移獲得的

      比較基因組研究發現,Vd991基因組某些LS基因(64個)與其他真菌屬的物種基因相似性更高;其中32個基因與Fusarium spp.基因組同源。進一步研究發現,有7個G-LSR2基因特異性存在于Vd991基因組(在JR2或VdLs.17中沒有這些基因),與F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433高度相似。F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433是一種土壤真菌,寄生于植物維管系統,可以引起棉花鐮刀枯萎病。推測Vd991可能是在與F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433共感染棉花維管系統的過程中,獲取了對應的LS基因或G-LSR2區域。

真菌denovo圖3

圖3. Verticillium dahliae 的LS基因和鐮刀菌屬基因同源性分析。Vd991的7個G-LSR2基因與F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433高度同源。

 

3. 7個Vd991菌株特異性G-LSR2基因與V.dahliae在棉花中的毒力高度相關

       為了确認G-LSR2對Vd991在棉花中的毒力的影響;通過基因敲除,得到兩株與F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433高度同源的7個LS基因缺失的Vd991突變株,并驗證它們的毒力;結果發現,兩個突變株對棉花的毒力顯著下降;而對番茄和莴苣的毒力并未受到影響。另一方面,将 Vd991特有的7個LS基因分别轉入JR2或VdLs.17基因組,發現其中三個基因可以增加真菌對棉花的毒力;而不影響其本身對番茄或莴苣的毒力。該生物實驗進一步驗證了G-LSR2在Vd991對棉花适應性的重要作用。

真菌denovo圖4

圖4. Vd991 G-LSR2區毒力因子鑒定。敲除G-LSR2區的7個LS基因,Vd991對棉花的毒力顯著降低,對番茄和莴苣的毒力不受影響。

 真菌denovo圖5

圖5. 将 Vd991特有的7個LS基因分别轉入JR2或VdLs.17基因組,VdLs.17 和 JR2對棉花的毒力和适應性均增加。



DNA樣本要求

二代測序
樣本類型 總量 濃度 完整性(膠圖) 純度
基因組DNA ≤800bp 文庫 1μg 12.5ng/μl 主峰>20Kb 無蛋白,RNA/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠
2-6Kb mate pair 文庫 20μg 100ng/μl
10Kb mate pair 文庫 30μg 70ng/μl 主峰>40Kb
≤800bp PCR free 文庫 10μg 30ng/μl 主峰>20Kb
 質粒,PCR産物等 ≤800bp 文庫 1μg 12.5ng/μl 條帶清晰無彌散 無蛋白,RNA/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠
≤800bp PCR free 文庫 3μg 30ng/μl



三代測序

樣本類型

總量

濃度

OD

完整性(膠圖)

純度

基因組DNA

微生物

20Kb library

≥8μg

≥60ng/μL

OD260/280 1.6-2.2;OD260/230 1.5-2.3

無降解或輕微降解(主峰在40K附近且彌散不低于20Kb

無蛋白,RNA/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠


Q1. 真菌樣品有什麼要求?客戶提取真菌樣品之後,是否有必要做一下16S 檢測?

答:建議送單倍體,我們建議送樣之前做一下16S檢測,或者TA 克隆,這樣可以避免細菌污染。

Q2. 對于一些寄生、不能單獨培養的真菌,我們能做嗎?

答:如果寄主的物種序列已知,我們可以将屬于寄主的序列過濾掉,再進行組裝,但是如果寄主的物種序列未知,這種就比較困難了。

Q3. 真菌的DNA樣品準備有什麼建議?

答:選取無性生殖階段、營養體的菌絲,避免在生成高等複雜結構的時期提取樣品。如果實驗條件允許,最好挑取單個孢子培養萌發大量菌絲,然後利用這些由同一孢子萌發的菌絲進行樣品制備。

Q4. 真菌初級組裝,高級組裝的區别是什麼?

答:初級組裝主要是對真菌的基因組大小、GC 含量高低、重複序列的多少、雜合度大小以及是否受到污染(受到污染的話,是何種污染)做一個評估和摸底;初級組裝文庫是一個小片段文庫,數據量為 50×,交付的指标隻有數據量上的承諾,沒有組裝結果的指标;

高級組裝采用二三代聯合組裝的策略,除構建二代小片段文庫和三代20K文庫以外,還會根據不同的實際情況,構建meta-pair大片段文庫,總共的數據量為120×-170×數據,且根據基因組大小和複雜程度承諾組裝指标為: contigN50≥2M(GS≤40M 的簡單真菌);scaffold N50≥500kb(GS≥40M,複雜真菌),組裝指标的提高,可以為信息分析的準确性和完整性提供保障。


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