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産品服務

Sequencing services

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16S/18S/ITS 擴增子測序

産品介紹

       16S rDNA是細菌分類學研究中最常用的“分子鐘”,其序列包含9個可變區(Variable region)和10個保守區(constant region)。可變區因細菌而異,且變異程度與細菌的系統發育密切相關。通過檢測16S rDNA的序列變異和豐度,可以了解環境樣品中群落多樣性信息。基于16S rDNA的分析在微生物分類鑒定、微生态研究等方面起到重要作用

       18S rDNA或ITS(Internal Transcribed Spacer)被廣泛應用在真菌分類鑒定中。18S rDNA在系統發育研究中較适用于種級以上階元的分類;ITS屬于中度保守區域,利用它可研究種及種以下的分類階元。 


研究内容

       16S/18S/ITS擴增子測序即通過提取環境樣品的DNA,選擇合适的通用引物擴增16S/18S/ITS的某一或某幾個區,使用Illumina測序将目的區域正反向讀通,通過檢測目的區域的序列變異和豐度,對環境樣本物種分類及,豐度,種群結構,系統進化,群落比較等方面信息進行分析的研究方法。

 

産品優勢

策略多樣:不同來源樣本采用不同提取方法和建庫測序策略,滿足多種環境研究需求

平台多樣:MiSeq/HiSeq2500/HiSeq4000/PacBio等多種平台可供選擇,可滿足16S/18S/ITS不同高變區域或全長測序的需求。

經驗豐富:已測序樣品類型涉及糞便、土壤、水體、唾液、牙菌斑、體腔、胃液、白帶、空氣、血液、皮屑等。

分析自動化:自動化分析平台,可多次提交不同的信息分析方案,客戶可以主導信息分析過程。

售前、售後服務:提供結題報告解讀視頻及其他個性化售前售後服務。

樣本需求量低:華大基因16S産品推薦DNA樣本量50ng以上,樣本量需求低于同行其他公司要求;對于樣本獲取困難的樣本,隻要樣本量高于0ng也有可能建庫成功。

免費建庫優化:16S産品建庫的核心環節是對目的片段的PCR擴增,受模闆DNA和體系純度(含有雜質,鹽離子,色素,腐殖酸等)等因素影響,16S産品建庫成功率普遍低于其他測序類産品(如重測序、宏基因組等)。為了提高16S建庫成功率,對于樣本量充足的樣本(樣本量>230ng),一旦第一次建庫失敗,華大基因會免費進行一次優化建庫。

數據交付指标高:華大基因對16S産品承諾交付clean tags(用于後續OTU/物種分析的有效數據量),承諾100%滿足合同數據量。常見的16S數據交付指标有raw reads、clean reads、raw tags,clean tags等,受數據質量和目标區域長度的影響,一般的數據利用率(clean reads/raw reads)和拼接率(clean tags/clean reads)會在50%~100%之間波動。


應用範圍

醫學領域:人體微生物與人體健康/疾病的關系,人體微生物對疾病幹預過程的影響;

動物領域:腸道、瘤胃(如産甲烷菌類群)與動物健康/營養消化研究等;

農業領域:根際微生物與植物互作、農業耕作/施肥處理與土壤微生物群落等;

環境領域:霧霾處理、污水治理、石油降解、酸性礦水處理及海洋環境等;

特殊極端環境:極端環境條件下的微生物類群研究,如冰川、火山等。


 技術流程

       取質量合格的基因組DNA樣品30ng及對應的融合引物配置PCR反應體系,設置對應的PCR反應參數進行PCR擴增,使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴增産物進行純化并溶于Elution Buffer,貼上标簽,完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 對文庫的片段範圍及濃度進行檢測。檢測合格的文庫根據插入片段大小選擇合适的平台(HiSeq/MiSeq)進行測序。下機數據經過數據過濾,濾除低質量的reads,剩餘高質量的Clean data方可用于後期分析;通過reads之間的Overlap關系将reads拼接成Tags;在給定的相似度下将Tags聚成OTU,然後通過OTU與數據庫比對,對OTU進行物種注釋;基于OTU和物種注釋結果進行樣品物種複雜度分析以及組間物種差異分析。


 建庫流程

       16S/18S/ITS擴增子建庫推薦融合引物建庫方法,即提前合成融合了目标序列引物和上機接頭、index等序列的引物,通過一步PCR擴增直接完成建庫。主要步驟如下:

樣品檢測:使用Qubit對樣品濃度進行精确定量,檢測合格的樣品進行文庫構建。

PCR體系構建:取30ng DNA樣品及融合引物配置PCR反應體系。

PCR擴增:設置PCR反應參數進行PCR擴增。

産物純化:使用Agencourt AMPure XP磁珠進行純化并溶于Elution Buffer,貼上标簽,至此文庫構建完成。

文庫質量檢測:文庫檢測使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫的片段範圍及濃度。

上機測序:文庫檢測合格,上機測序


 測序策略

 

擴增區域

引物名稱

引物對

測序類型*

細菌

V4

515F

GTGCCAGCMGCCGCGGTAA

PE250

806R

GGACTACHVGGGTWTCTAAT

V1-V3

8F

AGAGTTTGATYMTGGCTCAG

PE300

518R

ATTACCGCGGCTGCTGG

V3-V4

341F

ACTCCTACGGGAGGCAGCAG

PE300

806R

GGACTACHVGGGTWTCTAAT

V4-V5

515F

GTGCCAGCMGCCGCGG

PE300

907R

CCGTCAATTCMTTTRAGT

真菌

ITS1

its1

CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA

PE250

its2

GCTGCGTTCTTCATCGATGC

ITS2

its3

GCATCGATGAAGAACGCAGC

PE300

its4

TCCTCCGCTTATTGATATGC


*注:隻有兩端完全測通的Reads (Tags)才能用于進一步的分析,因此不同的擴增區域請嚴格遵循對應的測序類型。


信息分析内容

       下機數據經過數據過濾,濾除低質量的reads,剩餘高質量的Clean data方可用于後期分析;通過reads之間的Overlap關系将reads拼接成Tags;在給定的相似度下将Tags聚成OTU,然後通過OTU與數據庫比對,對OTU進行物種注釋;基于OTU和物種注釋結果進行樣品物種複雜度分析以及組間物種差異分析。

信息分析條款

信息分析内容

數據處理

  • 數據過濾
  • Reads拼接
  • OTU聚類與注釋

基于OTU的分析

  • Rank Abundance
  • PCA分析
  • Venn圖
  • Alpha多樣性分析
  • 稀釋曲線、Chao曲線、Ace曲線、Shannon曲線、Simpson曲線 
  • 組間樣品Alpha指數盒形圖及差異檢驗
  • 基于OTU豐度beta多樣性分析
  • Beta多樣性熱圖
  • PCoA
  • 樣品聚類樹
  • CCA分析(需提供詳細的環境因子數據)

基于物種的分析

  • 物種注釋柱形圖
  • 物種豐度熱圖
  • 物種系統發育進化樹
  • 基于物種系統進化的(Un)weighted_UniFrac分析
  1. Beta多樣性熱圖
  2. PcoA
  3. 樣品聚類樹
  • 組間物種比較分析(Metastats)

LEFSE分析

  • LEfSe組間群落差異分析

定制化信息分析

  • 16S測序樣品功能預測(PICRUSt
  • 物種間相關系數網絡圖分析
  • 可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析内容。


案例一:女性生殖道微環境及其與生殖健康的關聯

The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases (Nature communications, 2017).

       該項研究是目前最大規模的育齡女性生殖道微生态研究項目,采用16S檢測技術對女性盆腔與上下生殖道各部位菌群分布及與生殖系統疾病的關聯進行研究。其研究成果打破了“盆腔和上生殖道為無菌環境”的傳統認知,發現正常女性盆腔與上生殖道亦存在微生物,這首次揭示了生殖道從陰道到宮頸管、宮腔、輸卵管,直至盆腔的菌群結構具有一定連續性,并提出盆腔與女性生殖道微生态環境和生殖系統健康及相關疾病具有重要的關聯性。

樣本來源:采集了110名因良性疾病接受手術治療的育齡女性生殖道不同部位的樣本,包括陰道下1/3(CL)、陰道後穹窿(CU)、宮頸管(CV)、子宮腔(ET)、輸卵管(FL)及盆腔液(PF)

主要方法:16S rRNA基因擴增測序分析、實時定量PCR和微生物傳統培養法分析。

主要分析點:物種分析、樣本間多樣性分析、功能預測、表型關聯分析、評估模型構建。

主要結果:

  1. 上生殖道并非無菌環境,從陰道到輸卵管及盆腔,各部位微生物物種組成呈解剖結構上的漸進性變化

16S 文獻 圖1

圖1. 生殖道不同部位微生物群落結構。a, Weighted UniFrac PCoA圖;b, Unweighted UniFrac PCoA圖;c, 生殖道不同部位微生物豐度餅圖(屬水平)。

2. 同一個體不同部位的樣本間具有很高的相關性,不同個體間菌群組成變化明顯。此外,同一個體的宮頸管樣本與腹腔液樣本具有顯著的相關性,表明在普通人群中可以通過分析易取得的宮頸粘液樣本來評價宮腔和腹腔的菌群分布狀況。

16S文獻圖2

圖2. 不同個體/同一個體不同部位微生物群落結構一緻性。a, 同一個體不同部位的微生物群落結構與陰道下1/3(CL)的相似性;b, 同一個體不同部位的微生物群落結構與盆腔液(PF)的相似性;c, 同一個體不同部位的微生物群落結構Sorenson indices結果;d, 不同個體不同部位的微生物群落結構Sorenson indices結果

3. 對表型信息進行關聯分析發現月經周期、孕産次數以及子宮内膜異位症、子宮腺肌症等多種疾病相關的不孕等都與生殖道菌群的變化有關。

16S文獻圖3

圖3. 生殖道微生物功能(預測的)與女性生理周期的關聯分析



DNA樣本送樣建議


Meta擴增子測序

樣本類型

總量

濃度

完整性(膠圖)

純度

擴增子建庫

基因組DNA

0ng(推薦50ng以上)

0ng/μl

必須為基因組樣本

無蛋白,RNA/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

PCR-Free建庫

PCR 産物

3μg

30ng/μL

條帶清晰無彌散

Meta rDNA Amplicon Sequencing包括Meta rDNA V3,V6,V4,V1-V3,V3-V4,V4-V5,V5-V6,ITS1,ITS2區域Amplicon建庫,這類文庫主要核心實驗環節是PCR擴增,擴增成功率受模闆DNA和體系純度(含有雜質,鹽離子,色素,腐殖酸等)等因素影響,所以Meta rDNA Amplicon需要根據第一次建庫擴增成功與否來判斷樣品是否合格。

組織樣本送樣建議

組織類型

Meta擴增子測序

糞便樣本

≥100mg

土壤樣本

≥200mg

常見樣本采樣建議

(一)液氮速凍法

① 人和大型動物糞便樣品的采集

a) 準備好便盆和糞便容器,洗手,帶上手套收集新鮮的糞便樣本;

b) 在實驗室将裝好受試者糞便樣本,立即進行分裝并标記;

c) 用無菌牙簽或糞便取樣器截取樣品中段裡部(糞便表層含有腸粘膜脫落細胞;

外部容易污染,且接觸空氣後,部分細菌DNA 開始降解),取約50~100mg (約花生米大小,裝入2.0mL離心管不超過1/3體積)到無菌的2.0mL離心管中,每個樣本取3-5管備份

d) 分裝好後,立即液氮速凍或直接放入-80℃低溫保存,送樣時選擇幹冰運輸寄送。

如糞便樣品量較多或不能馬上凍存,最遲要在2小時之内全部收集完。

② 小型動物(如鼠)顆粒糞便樣品采集

動物顆粒糞便樣品,動物排便後立即裝入2.0mL離心管中(小鼠糞便3粒每管),放入-80℃低溫保存,送樣時選擇幹冰運輸寄送。

③ 腸道内容物樣品采集

a) 用無菌解剖刀,在無菌狀态下取出整個腸道,切取所需腸段的内容物(條件允許的話,可在無菌操作台進行);

b) 用無菌手術刀挖取内容物,裝入無菌2.0mL離心管中,每管取約50~100mg (約花生米大小,裝入2.0mL離心管不超過1/3體積)到無菌的2.0mL離心管中,每個樣本取3-5管備份;

c) 分裝好後,立即放入-80℃低溫保存,送樣時選擇幹冰運輸寄送。

④ 腸道組織樣本采集

a) 組織樣本用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕清洗,直到沒有内容物流出;

b) 用無菌的顯微鏡玻片刮取附着在表面的組織細菌,轉移到無菌的2.0mL離心管中;

c) 立即轉入-80℃低溫保存,送樣時選擇幹冰運輸寄送。

⑤ 土壤meta樣品采集

a) 根據研究目的确定采樣範圍,取樣器具要事先消毒滅菌處理,開始采樣;

b) 去除表面浮土,使用乙醇火燒的鏟子挖取地下5~20cm的土層;

c) 去除可見雜質後,土壤過2mm篩網,建議每個樣品從3個及以上采樣點采集并混合而成,把土樣裝入無菌2.0mL離心管中,每管取約50~100mg (約花生米大小,裝入2.0mL離心管不超過1/3體積)到無菌的2.0mL離心管中,每個樣本取3-5管備份;

d) 分裝好後,立即轉入-80℃低溫保存,送樣時選擇幹冰運輸寄送。

⑥ 水體樣本采集

a) 根據研究目的确定采樣深度和範圍;

b) 采集好的水樣需要通過濾膜進行過濾,可以根據水樣的渾濁程度選擇相應孔徑的濾膜;

c) 将濾膜轉移到2.0mL離心管中,立即轉移至-80℃低溫保存,送樣時選擇幹冰運輸寄送。

清亮水樣:可選擇小孔徑的濾膜,一般選0.22μm或0.45μm的濾膜,過濾水樣體積大于10L;

渾濁水樣:過濾前靜置分離懸浮顆粒,也可以用大孔徑的濾膜預過濾一遍,再用小孔徑的濾膜進行過濾。

(二)商業核酸保護液保存法

人糞便樣品可采用常溫采樣套裝,具體請按照說明書操作保存運輸樣品。


Q1. 16S産品有樣品數量的要求,需要所有樣品準備好了才能進行測序分析嗎?

答:從分析角度,同一處理建議至少4個樣本進行分析。從科學的角度來講,最好能夠整批樣品同時測序分析,既可以減少不同批次間的系統誤差,還能節省項目周期若樣品準備有困難。也可以分批次啟動,但需與客戶說明由此可能帶來的系統誤差問題。

Q2. 不同環境樣本數據量要求?

答:一般推薦簡單環境(如人腸道、發酵液等)測序數據量為25,000tags;複雜環境(如土壤、海水)等推薦數據量為60,000tags以上。

Q3. 16S測序能不能進行功能分析?

答:16S測序主要是基于16S rDNA 序列相似性進行OTU聚類進而進行物種注釋及相關多樣性研究。因為16S測序并沒有測到對應無或轉給你的基因組信息,不能直接基于測序結果進行功能注釋。

利用軟件PICRUSt可以進行16S功能預測,該軟件的原理是:對由16S測序分析得到的OTU豐度進行拷貝數均⼀化,得到樣品中可能出現的細菌及數目,從細菌的基因組信息得到對應的基因信息及注釋信息,再結合均⼀化的OTU豐度來預測樣品中可能存在的各級KEGG通路及豐度值以及COG功能信息及豐度值。

基于16S的功能預測可以作為後續功能研究提供參考,但由于該分析不能反映群落中因基因表達差異導緻的功能差異。如果主要關注功能差異,最好選擇宏基因組測序來進行功能研究。

Q4. 16S相關文章中選擇的測序區域各不相同(如V4,V3-V4,V1-V3,V3等),選擇的依據是什麼,選擇哪個區域比較好?

答:不同物種不同區域多樣性不同,選擇不同區域測序結果會有不同,可能會造成物種多樣性的低估或高估。在非全長16S測序的情況下,測序區域也并非越長越好,跟全長16S結果最相近的測序區域即是最優選擇。

如無特殊要求,我們一般推薦V4區測序,有文獻表明V4區測序結果和全長的結果一緻性較好[2]。

根據我們大量的項目經驗,目前測序項目較多的區域為V4, V1-V3, V3-V4, V4-V5, V5-V6,具體項目測序區域也可參考相關文獻進行選擇。

16S FAQ圖1

圖1. 不同物種16S各可變區變異程度不同

Q5. 16S樣本要求有哪些,樣本準備有哪些注意事項?

答:華大基因對16S樣本要求如下:

Meta擴增子測序

樣本類型

總量

濃度

完整性(膠圖)

純度

Meta rDNA Amplicon

Genomic DNA

≥0ng(推薦50ng以上)

≥0ng/μl

必須為基因組樣本

無蛋白,RNA/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

Meta rDNA Amplicon

PCR-free Library

PCR products

≥3μg

≥30ng/μL

條帶清晰無彌散

一般16S建庫選擇基因組樣本,推薦樣本量在50ng以上,如果樣本準備困難,大于0ng也可以嘗試建庫。

16S産品建庫受模闆DNA和體系純度(含有雜質,鹽離子,色素,腐殖酸等)等因素影響,在取樣過程中,盡量減少宿主細胞含量及其他雜質的影響。

樣本采集後盡快放入-80℃凍存,幹冰運輸,減少樣本降解導緻的微生物群落結構變化。

Q6. 我的樣本檢測合格了,樣本量也達到了推薦樣本量要求,卻建庫失敗了,可能是什麼原因造成的,有沒有什麼解決方案?

答:這種情況常見于宿主微生物樣本,該類樣本通常還有大量的宿主DNA,由于樣本檢測中不能區分宿主和微生物DNA,實際檢測到的DNA其實絕大多數都是宿主DNA,導緻檢測到的樣本量很高,卻建庫失敗的情況。

對于這類樣本,推薦在樣本制備過程中進行特殊處理,盡量減少宿主DNA含量。目前市面上有可以去宿主DNA的試劑盒(如QIAamp DNA Microbiome Kit),對于宿主含量較高的樣本如唾液、粘膜樣本等,可以選擇對應的試劑盒處理。

Q7. 16S測序一般推薦多少樣本量?

答:16S樣本多樣性及組間差異分析是基于統計結果進行的分析,一般樣本數越多,統計結果越準确。最低樣本數要求如下:

樣本間多樣性分析(n≥4),組間多樣性分析樣本(組别≥2,每組樣本數n≥3)。

Q8. 16S測序如果樣本含有較多宿主DNA,是否需要增加測序數據量?

答:16S擴增子測序是對微生物16S rDNA 特定區域進行擴增并測序分析的産品,擴增産物不包含宿主的信息。所以樣本中宿主DNA并不會對測序結果造成影響(宿主DNA含量過高可能會導緻建庫失敗),測序過程中也無需增加數據量。

宏基因組測序是對環境中所有物種進行全基因組測序的産品,樣本中宿主DNA含量較高會導緻宏基因組測序宿主比例偏高,微生物有效數據量相對較少,這種情況下可以通過增加測序數據量來增加有效數據。


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