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免疫組庫測序

        T/B細胞是适應性免疫系統的兩大細胞群,細胞表面受體TCR/BCR存在一塊區域叫互補決定區(Complementary Determining Region, CDR),包含CDR1、CDR2、CDR3,其中CDR3最高變,在抗原識别中起關鍵作用。華大的免疫組庫測序是通過多重PCR和高通量測序技術,分析編碼CDR3區的DNA/RNA序列,獲得機體的免疫特征。

免疫組庫圖示
圖1 免疫組庫圖解

産品優勢

一站式服務:提供從CDR3的擴增、建庫、測序、後續信息分析以及數據挖掘一系列全方位的服務;

有針對性的研究方法:針對CDR3的V區及J區兩端設計引物,目的擴增CDR3區域;

擴增偏好性低:采用兩步法建庫,并優化引物配比,将擴增偏好性降低約70%;

可重複性高:同一樣本建庫兩次克隆一緻性高;

重複性
圖2  同一樣本實驗重複性評估(Hiseq)

更豐富的分析結果:新增多種結果統計圖表;新增V/J基因頻率分布統計、多樣品聚類分析、共性分析、差異分析;新增四種多樣性評估指标;

更友好的xbio結題報告展現形式:全新升級的結題報告界面友好,對分析方法及結果解釋詳盡,圖表按照發表文章要求展示,讓您一目了然;

更真實的克隆定量信息:将低質量reads與高質量克隆進行比對,挽回重要數據,讓克隆定量信息不丢失;

更強的糾錯能力和錯配處理能力:利用多層聚類方法,糾正PCR和測序引入的錯誤;錯配處理能力提升,更适合分析BCR的高突變區域。

 

 産品應用

 免疫組庫應用2

 

服務内容

目的鍊

目标區域

樣品類型

擴增方法

測序策略

TCRα 或 TCRβ

CDR3

DNA 或 RNA

M-PCR (VJ)

PE150

BCRH 或 BCRL

CDR3

DNA 或 RNA

M-PCR (VJ)

PE150

BCRH (鑒定抗體亞型)

CDR3

RNA

M-PCR (VC)

PE150

 

信息分析内容

1、基本數據統計


     數據過濾,對原始數據進行去除接頭污染及低質量reads的處理

     數據搭建,數據拼接,消除測序背景及有效數據構建

     數據統計,數據産出統計及測序數據的成分和質量評估

2、數據比對分析

     比對分析,與數據庫V/D/J基因片段比對

     比對結果統計

3、克隆序列特征注釋

    CDR3區核酸序列和氨基酸序列

    鑒定無效序列(包含終止密碼子,超出結構範圍)

    鑒定單堿基突變(替換、删除、插入)(for BCR)

4、單樣品克隆群體特征分析

    CDR3序列長度分布

    V/J基因頻率分布

    V-J基因組合頻率分布(3D, Circos)

   克隆群體結構分析(頻率分布,D50曲線,甜甜圈圖)

5、樣品間比較分析


    測序飽和度分析

    克隆多樣性分析(辛普森系數、香農威納系數等)

    樣品間共有克隆分析

    聚類分析(層次聚類,MDS聚類)

    組間差異分析


腫瘤案例: TCR克隆異質性與新抗原異質性及肺癌複發的關系

Cancer Discovery. 2017 Oct;7(10):1088-1097.

研究目的:尋找免疫檢查點(PD-1、CTLA-4)治療療效的biomarker

研究樣本:11例未轉移肺腺癌,共45 tumor regions (2 to 5 regions per tumor)

研究技術:WES、TCR sequencing

研究結果:病竈特有突變導緻新抗原(neoantigen)的内部表達差異,因此,産生不同的免疫原性,形成了TIL克隆内部差異(TCR ITH)。TCR ITH(intratumor heterogeneity)高與術後疾病複發和低生存率有關。 

 案例圖1

圖1 TCR克隆異質性(ITH)與肺腺癌基因組和臨床的相關性

(A)年齡與MOI相關性;(B)新抗原與MOI負相關;(C)複發的病人具有更高的TCR ITH(lower MOI);(D)MOI越高(TCR克隆多樣性越低),病人的無病生存期(disease-free survival)越長。MOI:克隆重疊指數,範圍0-1,0代表克隆完全不同,1代表克隆完全相同。

 

感染類疾病案例:TCRβ序列特征可準确預測CMV感染狀态

Nature Genetics. 2017, 49(5): 659-665.

研究目的:确定是否可以用TCR特征預測CMV(巨細胞病毒)感染狀态。

研究樣本:群體1:共計666個樣本,其中289個CMV陽性,352個CMV陰性,40個感染狀态未知;群體2:120個驗證樣本。

研究結果:對289個CMV+和352個CMV-樣本進行免疫組庫測序,發現了CMV相關的TCRβ序列特征,并且利用TCRβ可以從666個研究樣本和120個驗證樣本中,準确鑒定出CMV感染狀态。研究還發現該群體的TCRβ與HLA-A或HLA-B顯著相關。

案例圖2

圖2 TCRβ可預測CMV感染狀态

(a)CMV+和CMV-樣本中unique TCRβ分布散點圖。(b)ROC曲線顯示TCRβ作為CMV感染狀态分類器的分類效果。其中虛線表示在群體1中的測試結果,短虛線代表群體1中的交叉驗證效果,實線代表群體2中獨立驗證效果。每條線上的黑圈代表最大後驗概率(MAP)的決定阈值。插入圖表展示的是群體2中MAP分類效果,敏感度為0.90,特異性為0.89。

 

自身免疫性疾病案例:殺傷T細胞的突變積累可能與類風濕性關節炎發病有關

Nature Communications. 2017, 8:15869.

研究目的:大顆粒淋巴細胞白血病(LGL)常合并發生類風濕性關節炎(RA),研究發現LGL病人的CD8+ T細胞克隆存在STAT3突變,而擁有該突變的LGL病人更容易并發RA(43% vs. 6%)。因此推測,發生體細胞突變的CD8+ T細胞可能與RA發病有關。

研究樣本:82例新診斷未治療的RA病人,20例健康人,取外周血。

研究結果:首次采用CD4+ T細胞做對照,過濾生殖系突變(germline mutations),對分選的T細胞進行目标區域測序、外顯子測序和TCR β鍊CDR3測序。發現,大約20%(5/25)病人的CD8+ T細胞有體細胞突變(somatic mutations),而CD4+ T細胞沒有,RNA-seq确認了突變基因在CD8+ T細胞中高表達。功能分析發現,這些基因突變與免疫調控、細胞增殖有關,因此推測,發生體細胞突變的CD8+ T細胞可能與RA及其他自身免疫性疾病的發病有關。

 案例圖3

圖3 病人1中CD8+ T細胞的克隆分布及突變

(a)利用TCR測序獲得的CD8+ T細胞克隆分布。(b)病人1中存在兩個高頻克隆,經過免疫抑制治療後仍高表達。(c)利用擴增子測序,在流式分選後的亞群中進行突變驗證。(d)本文研究思路圖。

 

華大基因已發表IR-seq相關文章

研究内容

發表時間

發表期刊

影響因子

文獻标題

肝癌亞型差異分析

2015.04

Oncoimmunology

7.72

Identification of characteristic TRB V usage in HBVassociated HCC by using differential expression profiling analysis

分析軟件

2015.08

Genetics

4.56

IMonitor: a robust pipeline for TCR and BCR repertoire analysis

駱駝

2016.09

PLoS One

2.81

Comparative Analysis of Immune Repertoires between Bactrian Camel's Conventional and Heavy-Chain Antibodies

實驗方法學

2016.03

PLoS One

2.81

Systematic Comparative Evaluation of Methods for Investigating the TCRβ Repertoire.

肝癌

2015.07

Cancer Letters

6.38

Immune repertoire: A potential biomarker and therapeutic for hepatocellular carcinoma

原發性膽汁性膽管炎

2016.09

Journal of immunology

4.86

Clonal Characteristics of Circulating B Lymphocyte Repertoire in Primary Biliary Cholangitis

微小殘留病

2016.10

Frontiers in Immunology

6.43

Minimal Residual Disease Detection and Evolved IGH Clones Analysis in Acute B Lymphoblastic Leukemia Using IGH Deep Sequencing

預測V/J基因軟件

2016.11

Frontiers in Immunology

6.43

IMPre: An Accurate and Efficient Software for Prediction of T- and B-Cell Receptor Germline Genes and Alleles from Rearranged Repertoire Data

乳腺癌、癌旁和淋巴結的TCR分析

2017.02

Cancer Immunology Research

8.28

The Different T-cell Receptor Repertoires in Breast Cancer Tumors, Draining Lymph Nodes, and Adjacent Tissues

結腸腺瘤和結腸癌浸潤淋巴細胞

2017.05

Journal of immunology

4.86

Characterization of the B Cell Receptor Repertoire in the Intestinal Mucosa and of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Colorectal Adenoma and Carcinoma

免疫缺陷

2015.12

Human Molecular Genetics

5.99

DCLRE1C (ARTEMIS) mutations causing phenotypes ranging from atypical severe combined immunodeficiency to mere antibody deficiency

腎移植

2016.11

Transplant Immunology

1.32

T cell repertoire following kidney transplantation revealed by high-throughput sequencing


分析内容圖1

圖1 克隆群體特征分析

A,V-J基因組合頻率Circos圖,每個顔色塊代表一種基因,顔色塊越寬,頻率越高。色塊間的連線代表一種V-J基因組合方式。B,克隆頻率分布,橫縱坐标分别為克隆數和克隆頻率。C,克隆頻率分布甜甜圈圖。第一層為1個reads、2個reads及≥3 reads支持的克隆類型比例;第二層為≥3 reads支持的克隆類型中,top 20%、20%-40%、40%-60%、60%-80%、80%-100%克隆的累積頻率分布;第三層為top5克隆類型的頻率分布及對應的氨基酸序列。D,Top20 V基因頻率組間分布柱狀圖。


表1 免疫組庫DNA/RNA送樣建議

樣本類型

總量

濃度

RIN

28S/18S

基線和5S

純度

Sorted T cells RNA / PBMCs RNA

≥500ng

≥35ng/μL

RIN≥7.0

28S/18S≥1.0

基線平整,5S峰正常

無DNA,蛋白/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

Whole blood RNA/ Tissue RNA

≥1μg

≥70ng/μL

RIN≥7.0

28S/18S≥1.0

 

表2 免疫組庫組織送樣建議

組織類型

提取DNA建議送樣量

提取RNA建議送樣量

分選細胞

≥1×106

≥2×105

新鮮動物組織幹重

≥200mg

≥30mg

全血

≥2mL

≥ 1 mL全血收集的淋巴細胞or ≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血

注意:對于組織樣品,若淋巴細胞含量低,存在擴增不出來的狀況。


Q1: TCR和BCR各條鍊編碼基因的區别?推薦哪條鍊?

TCR Beta鍊和BCR重鍊是由V、D、J基因編碼的,而TCR alpha鍊和BCR輕鍊是由V、J基因編碼的。從發表文章來看,研究TCR beta鍊和BCR重鍊的比較多。

Q2:免疫組庫測序可以區分IgG、IgM、IgD、IgE嗎?

免疫球蛋白的亞型,通過C區序列可以區分,華大有相應的引物,但必須是RNA樣品。利用多重PCR的方法,利用V區-C區的引物,用約30bp的序列區分。産物長度大約是在200-300bp。

Q3:免疫組庫的測序深度?能得到多少序列?

分析數據顯示,數據量的增加,主要影響低頻克隆,并且這些克隆的排序在一千多到九千不等,而研究往往隻關注top100的克隆和疾病的關系,所以推薦起始數據量1G raw data。但如果客戶想關注更多低頻克隆,可以加大測序數據量。

Q4:做免疫組庫測序,用基因組DNA做模闆好,還是RNA好?

DNA水平側重于研究基因重組信息,RNA水平側重于研究基因的表達狀态。使用DNA和RNA做模闆各有優缺點:

gDNA的優點是:

1)因為每個基因隻有兩個拷貝,因此可準确地反映免疫細胞受體的克隆數;

2)DNA更穩定,易儲存。

缺點是:

1)由于copy數不高,模闆含量低,因此可能需要更多的樣品;

2)由于J區和C區之間有很大的intron區,受測序長度的局限,缺少特異性擴增引物來擴增CDR全長。

RNA的優點是:

1)J區和C區之間無intron,可用C區進行引物設計,擴增全長CDR;

2)由于表達豐富,模闆含量高,樣品消耗量少。

缺點是:

1)免疫細胞受體的克隆性受到mRNA表達高低的影響,不能客觀地反應本身的克隆數;

2)RNA不如DNA穩定,樣品保存和操作要求較高。


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