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UMI Small RNA 測序

        UMI Small RNA測序,文庫構建時引入特異性分子标簽(UMI),結合高通量測序,研究某物種某組織在特定時空狀态下18-30 nt的small RNA片段序列信息,實現絕對定量,通過與數據庫比對, 可實現small RNA序列的鑒定、靶基因分析和功能分析, 以及包含miRNA、siRNA、piRNA等多種small RNA類型的分析研究需求等。主要應用在動植物生長發育調控研究、抗病抗逆調控研究、生物性狀及突變調控研究等;在疾病研究方面,可研究疾病發生調控機制、尋找生物标記、靶向藥物研究等。

技術優勢

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研究内容

        利用BGISEQ平台,對富集到的18-30nt的小RNA片段進行測序,對獲得的有效數據進行序列長度分布統計,将篩選後的高質量序列分類注釋,從而獲得樣品中包含的各組分及表達量信息,并對所有小RNA片段進行注釋,對miRNA進行靶基因預測等分析。

一、标準分析

1、數據産出統計,對原始信息采集數據去接頭污染,去低質量reads         

2、18-30 nt Small RNA 信息采集結果的長度分布         

3、Small RNA在選定的參考基因組上的分布(隻能選定一個參考基因組)

4、Small RNA分類注釋

①Small RNA與rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比對信息   

②Small RNA與重複序列的比對信息

③Small RNA與exon/intron的比對信息    

④Small RNA與miRBase中指定範圍的已知的miRNA的比對

⑤miRNA家族分析

⑥動物保守piRNA注釋分析(分析僅針對數據庫中已有的物種:人、小鼠、斑馬魚、線蟲、果蠅、大鼠、雞、家蠶)

5、Small RNA預測(miRNA/siRNA/piRNA)

6、已知和新Small RNA 定量分析(miRNA/siRNA/piRNA)

7、已知和新Small RNA差異表達分析(miRNA/siRNA/piRNA)

8、已知和新miRNA表達/差異表達聚類分析

9、已知和miRNA 靶基因預測

10、差異miRNA 靶基因GO 注釋和KEGG 通路分析

二、高級分析

1、差異miRNA與差異靶基因的相關性分析;

2、差異miRNA與差異靶基因互作網絡繪制;

3、互作靶基因功能富集分析(KEGG和GO);

三、定制化信息分析

可結合客戶的材料與需求,協商确定定制化信息分析内容。


疾病miRNA表達譜——microRNA分析揭示IL1途徑在風濕性心髒瓣膜病中潛在增強

Comprehensive microRNA profiling reveals potential augmentation of the IL1 pathway in rheumatic heart valve disease[J]. BMC cardiovascular disorders, 2018, 18(1): 53.

研究摘要

        心髒瓣膜病是心血管病死亡的主要原因,中國尤甚,超過一半的心髒瓣膜病是由急性風濕熱引起,但心髒瓣膜病的miRNA譜未知。本次研究采用4例風濕性心髒病患者(2例中度,2例重度)和1例健康人對照的血清樣本進行高通量測序,患者中共有的下調miRNA 91個,上調miRNA 13個。進行靶基因和功能預測後,選取9個miRNA利用qRT-PCR做大樣本驗證。在40例患者(20例中度,20例重度)和20例健康人中,發現2個miRNA(hsamiR-205-3p和hsa-miR-3909)分散度低,風濕性心髒病患者顯著降低,先天性心髒病患者與健康人無明顯改變。預測hsamiR-205-3p靶向IL-1β,hsa-miR-3909靶向IL1R1,并利用熒光素酶測定驗證miRNA抑制靶基因表達。免疫組化測定靶基因編碼蛋白的表達量,得出在風濕性心髒病患者中比在先天性心髒病患者中IL-1β、IL1R1 的表達量更高。

研究結果

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圖1  患者中共有的91個下調miRNA、13個上調miRNA靶基因功能分析。

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圖2  9個miRNA利用qRT-PCR進行大樣本驗證。

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圖3  IL-1β、IL1R1在風濕性心髒病患者中比在先天性心髒病患者中表達量更高。

 

 miRNA機制研究——寄生昆蟲衍生的miRNA調節宿主發育

Parasitic insect-derived miRNAs modulate host development[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 2205.

研究摘要

        寄生蜂會産生毒液、多DNA病毒(PDV)、畸形細胞等,改變宿主的生理狀态有益于後代存活,但改變的潛在分子機制仍不清楚。本研究發現寄生蜂(C. vestalis)的畸形細胞、多DNA病毒(嵌入到寄生蜂基因組中特有的共生病毒)CvBV可以産生miRNA并通過不同方式将其傳遞到宿主中。寄生宿主小菜蛾(P. xylostella)中某些miRNA主要由畸形細胞産生,而寄生宿主中由CvBV編碼的miRNA的表達水平比非寄生宿主高100倍。一種畸形細胞産生的miRNA(Cve-miR-281-3p)和一種CvBV産生的miRNA(Cve-miR-novel22-5p-1)通過調節宿主蛻皮激素受體(EcR)的表達來阻止宿主生長。研究結果顯示miRNA在動物寄生中可以進行跨物種調控,及寄生期間宿主生理改變中miRNA的功能。

研究結果

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圖1  寄生蜂幼蟲和畸形細胞中的miRNA 特征

比對寄生蜂的基因組得到20個由多DNA病毒編碼的miRNA,由13個前體miRNA剪切加工形成。

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圖2  CvBV編碼的miRNA在CvBV感染的宿主小菜蛾中的表達。

i.小菜蛾三齡幼蟲注射CvBV;j. CvBV加入細胞培養基中進行細胞感染。

RT-qPCR驗證20個miRNA,其中17個miRNA可以驗證。

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圖3  RT-qPCR結果表明畸形細胞會釋放出特異的miRNA

驗證發現畸形細胞所編碼的miRNA必須分泌到胞外,并被寄主小菜蛾的血細胞所吸收才能起作用。

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圖4  Cve-miR-281-3p和Cve-novel22-5p延遲小菜蛾的生長和化蛹。

對畸形細胞中30個高表達miRNA進行靶基因預測,選擇具有同一靶标基因(EcR)進行功能驗證。RT-qPCR和免疫印迹檢測轉錄本豐度和蛋白質表達豐度。畸形細胞源的miRNA和CvBV源的miRNA都能作用于寄主小菜蛾蛻皮激素受體(EcR),下調寄主EcR的表達水平及蛋白水平,延遲小菜蛾的蛻皮和化蛹。


af_Life_UMI3

圖1  小RNA分類注釋

通過與已知的sRNA數據庫比對,鑒定小RNA,各類小RNA所占比例。

miRNA

圖2  差異表達miRNA   

X軸代表比較組,Y軸是對應的小RNA數。綠色代表下調,紅色代表上調。

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圖3  差異miRNA火山圖

圖中X軸表示差異倍數取log2的值,Y軸表示-log10(FDR),綠色的點表示顯著下調的sRNA,紅色的點表示顯著上調的sRNA。

af_Life_UMI3_af_Life_UMI4

圖4  差異表達小RNA層次聚類

X軸代表進行聚類分析的差異比對,Y軸代表差異基因。顔色代表差異倍數(顔色越紅代表表上調倍數越大,越綠代表下調倍數越大)。

af_QIA-vs-af_Life_DEGseq

圖5  KEGG通路注釋分類統計圖

橫坐标為差異小RNA的靶基因個數,縱坐标表示二級KEGG pathway通路。二級通路又分别屬于不同的一級通路,圖中用不同顔色表示一級通路類别。


表1  Small RNA組織樣品送樣建議

組織類型

具體要求

新鮮培養細胞(細胞數)

≥2×105cell

新鮮動物組織幹重

≥30mg

新鮮植物組織幹重

≥100mg

全血

≥ 1 mL全血收集的淋巴細胞

≥ 1 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血

菌體 (細胞數或幹重)

≥2×105cell or ≥30mg

FFPE

≥ 5片,未染色,100 mm2,5 ~ 10μm厚度

表2  Small RNA測序樣品判定标準

樣本類型

總量

濃度

RIN

28S/18S

基線和5S

純度

Total RNA (Plant / Fungi)

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥7.5

28S/18S≥1.3

基線平整,5S峰正常

無DNA,蛋白/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

Total RNA (Animals)

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥8.0

28S/18S≥1.5

Total RNA (Prokaryotes)

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥8.0

23S/16S≥1.5

FFPE RNA

≥1μg

≥50ng/μL

RIN≥2.0

DV200≥30%

Total RNA (Insect)

≥1μg

≥50ng/μL

N/A

Small RNA(<200nt)

≥100ng

≥5ng/μL

N/A

N/A

Small RNA of Plasma/serum

≥20ng

≥2ng/μL

N/A

N/A

 


Q1:小 RNA 測序對樣品提取有什麼特殊要求? 

        提取總RNA時建議不要使用Qiagen等公司的過柱試劑盒,也不要使用LiCl沉澱,以免丢失小片段RNA。如果直接提供small RNA樣品,可以使用small RNA提取專用試劑盒來進行提取。

Q2:華大可以實現什麼類型的樣品建庫測序?

         動植物總RNA樣品、微生物總RNA樣品、200nt以内的小片段RNA樣品、經切膠回收的small RNA樣品、組織培養與細胞系樣品、血清/血漿樣品、組織液樣品,FFPE樣品、RIP樣品,外泌體樣本等,隻要滿足華大送樣要求,均可在華大用于小RNA建庫測序。

Q3:為什麼實驗結果中會存在降解的 rRNA序列? 

        由于 total RNA 常發生輕微的降解,而生物體内也有自然的降解過程,因此數據中就會含有小部分 mRNA 降解片段。但通常這個比例很低,并且取決于樣品 total RNA 的質量。

Q4:進行小 RNA 測序時,客戶除了樣品以外還需要提供哪些相關信息? 

        需要提供相應物種的基因組和相關的 exon、intron、repeat 信息。如果沒有本物種的基因組,需要提供近緣物種的相關信息。 


 


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