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2個樣本怎麼發paper?單細胞轉錄組技術來幫忙!

近日,由華大基因團隊主導的對2個臍帶血樣本進行10X Genomics單細胞轉錄組研究的成果于5月正式在線發表,此項研究采用BGISEQ平台測序,發現臍帶血細胞具有特有細胞類型,相對外周血細胞具有明顯異質性,相關結果發表在GigaScience(影響因子4.668)。如此少的細胞樣本,竟能發高分文章?光環背後必然有過人之處,接下來科技君帶大家一起研究文章思路,一一揭秘。

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圖1. 文章整體研究思路圖


【高分秘籍】

✔  樣本處理很成功

看似無奇的兩個臍帶血樣本,但是細胞分選前處理不易,每一步均需要快速穩定處理,才能保證細胞活性,所以說,“根基”牢靠才是重中之重。

✔ 高通量細胞分選技術 & 高性價比、高質量DNBSEQ™測序技術

實現高效細胞分選,結合獨特的DNB納米球擴增技術,讓測序更保真,低DUP rate無需額外去冗餘。

✔  信息分析深挖掘

不僅對細胞類型進行鑒定,還與已有的外周血細胞數據一起對比分析,選擇數據庫已測數據聯合,性價比高又增分。

細胞亞群異質性分析細緻,多種類型,尤其是對免疫細胞以及特有細胞類型對比分析,凸顯臍帶血含有特異性免疫細胞;還包含對已有細胞類型進行細胞發育拟時間序列分析,分層次揭示階段性的基因表達差異,科學故事演繹完整。

原來如此,那麼主要研究結果有哪些呢?


【研究成果展示】

01、鑒定到特有細胞類型,臍帶血細胞具有特殊的免疫力


采用Seurat軟件進行細胞聚類,結果顯示:鑒定到11個細胞類型(圖2A),并對這11個主要的細胞類型的marker基因表達情況進行熱圖分析(圖2B)。其中有核紅細胞和粒細胞為臍帶血中特有,在外周血中很少見。且兩類血液中各細胞類型除去T細胞,B細胞和CD14+細胞外,其他的類型細胞的比例差異較大,尤其是骨髓來源細胞,說明臍帶血具有特殊的免疫力。

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圖2. 外周血和臍帶血不同細胞類型和比例

A. 二維對外周血和臍帶血細胞根據已知标記進行分類,左側圖為臍帶血細胞,右側圖為外周血細胞,對相同類型的細胞标記相同的顔色

B. 臍帶血和外周血中主要的已知标記的基因表達熱圖

C. 外周血樣本1/2 和臍帶血1/2細胞類型比例,使用相同的顔色(同分類A)标記


02、
臍帶血有核紅細胞在不同極性發育階段變化明顯


對有核紅細胞的表達基因進行拟時間序列分析,結果呈現一個線性軌迹,說明細胞極性是由基因表達的不斷變化引起的(圖3A)。


基因表達熱圖分析發現,這些基因如編碼紅細胞表面marker和蛋白,如 CD47, CD36, 血紅蛋白和血糖型蛋白,以及細胞穩态調控因子等在不同的極性階段表達呈現顯著差異(圖3B,C),同時也驗證到基因表達量和UMI數量也随着細胞極性發育而降低。

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圖3. 臍帶血有核紅細胞呈現明顯的極性

A. 通過Monocle2軟件進行臍帶血中的有核紅細胞發育時間軌迹分析

B. 編碼表面标記基因表達分類根據時間點分為三個表達階段:原始階段,中間階段,成熟階段

C. 臍帶血有核紅細胞轉錄調控因子表達也可以分為三類表達階段:原始階段,中間階段,成熟階段

D. 在每一個細胞中檢測到UMI數和基因數表達散點圖,每個點代表一個細胞


03、臍帶血祖細胞具有明顯異質性


臍帶血的祖細胞與造血幹細胞呈現類似的轉錄本表達譜,但是在細胞聚類結果中顯示,通過更精細分類分析,發現臍帶血祖細胞有一類特殊細胞亞群,說明臍帶血祖細胞具有異質性(圖4A.B),更有意思的是,另外一類亞群細胞僅來自臍帶血祖細胞(藍色點),且不表達造血幹細胞的典型标記基因(圖4C,4D)。

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圖4. 臍帶血樣本祖細胞呈現異質性特征

A. 臍帶血和造血幹細胞通過基因表達結果進行聚類,結果顯示,主要分兩大類,其中藍色代表臍帶中間體雙效細胞(ulBC),紅色代表造血幹細胞(HSC)

B. 造血幹細胞(HSCs)和中間體雙效細胞(uIBCs)群體進行聚類

C. 祖細胞亞類基因表達熱圖分析

D. 兩類細胞的特征基因表達差異比較的小提琴圖

E. 兩類細胞轉錄因子富集圖

F. 兩類細胞特異性轉錄組因子小提琴圖


04、自然殺傷T細胞在臍帶血細胞中表現異質性


選擇免疫細胞類型-NK細胞和T細胞以及附近區域細胞研究其異質性,結果顯示,外周血細胞和臍帶血細胞聚類成5個亞類(圖5), 通過使用關鍵marker基因CD3D和KLRB1對細胞進行聚類,發現:T和NK細胞在不同血液類型中呈現比較明顯的異質性。

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圖5. 在臍帶血和外周血中NKT細胞和NK細胞顯示功能異質性

A-D. 臍帶血(右)和外周血(左)中所有NK細胞和T細胞進行亞群分類。臍帶血和外周血均分為5大類(C/D)。黃色顯示CD3D的高表達;藍色表示KLRB1高表達細胞;紅色表示高度表達CD3D和KLRB1的細胞;灰色表示細胞不表達基因

E. 臍帶血和外周血中單細胞亞群中NK細胞和T細胞關鍵基因表達差異的小提琴圖(不同顔色代表不同亞群)

F. 臍帶血中含有GZMB+ NKT細胞和不含細胞毒素NKT細胞亞群表達基因差異的聚類熱圖

G. 臍帶血中含有GZMB+ NKT細胞和不含細胞毒素NKT細胞亞群表達基因GO功能富集分析


總的來說,這項基于單細胞轉錄組技術的研究揭示了未知的細胞類型、代謝途徑和基因表達調控,這些調控可能有助于評估臍帶血移植的療效和結果,拓寬了研究範圍和臨床創新。


華大科技推出的10X Genomics單細胞轉錄組技術,采用BGISEQ平台,經過多輪測試,其靈敏度、準确度和重現性方面與H平台具有高度可比性,為廣大科研人員提供了另一種高性價比測序平台的選擇。


DNBSEQ™測序技術BGISEQ-500平台優勢

✔  鑒定細胞數多

✔  鑒定的單個細胞基因中位數可到1.5K以上

✔  兩平台鑒定到的細胞分類類型一緻性高


表1. 主要基本分析結果對比

(數據來源腫瘤細胞各1條lane測序數據)

表格-3


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圖6. BGISEQ-500平台和H平台細胞進行降維分析-tSNE聚類分析,結果顯示,細胞分類結果趨勢一緻性高

(紅色:BGISEQ-500平台;藍綠色:H平台)


基于10年的單細胞研究經驗,華大科技已成功交付千例單細胞研究項目。現在,科研用戶足不出戶即可享受優質的10X Genomics上門建庫服務,珍稀臨床樣本研究成為科研新貴。



【參考文獻】

Zhao Y, Li X, et al. Single-cell transcriptomic landscape of nucleated cells in umbilical cord blood. GigaScience. 2019 May 1;8(5). giz047.  doi: 10.1093/gigascience/giz047.


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